介绍： 

材料与方法： 

   PCR使用的标准溶液和试剂 

   100 mM 母液的核苷酸 (dNTP) ( 购于 Pharmacia Biotech [Piscataway, NJ, USA] 或 Boehringer Mannheim [Indianapolis, IN, USA]) (25 mM each dATP, dCTP, dGTP and dTTP). 

   标准的 10xPCR 缓冲液 (Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA) 包含： 500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl, pH 8.3[at 24 ℃ ], 15 mM MgCl 2 . 

   Taq DNA 聚合酶 (Life Technologies [Gaithersburg, MD, USA]; Perkin-Elmer). 

   二甲亚砜 (DMSO), 牛血清蛋白 (BSA), 甘油 (Sigma Chemical [St. Louis, MO, USA]) 

   引物 (Genosys [The Woodlands, TX, USA]; Research Genetics [Huntsville, AL, USA])( 终浓度为 10–25 pmol/μL 。引物对 sY 用作检测 Y 染色体上的缺失 (8,16) ；还有 10–15 对引物用于检测 X 染色体上迪谢内肌营养不良基因 (DMD) (4) ；其余引物用于检测 12 号染色体上的多态性位点，引物按 Table 1 和 Figures 2b, 3b,5e 方案组合。 

   基因组 DNA 使用标准 SDS/ 蛋白酶 K 方法制备 (Boehringer Mannheim) 

基本 PCR程序 

   PCR 反应体积为 25μL ，包括：灭菌的超纯水、 PCR 缓冲液 (1x) 、 dNTP 混合物 (200μM each) 、引物 (0.04–0.6μM each); DMSO, 甘油或 BSA (5%); Taq DNA 聚合酶 (1–2 U/25μL) 和基因组 DNA 模板 (150ng/25μL) 。先加入水，其它组分可以任意顺序加入，加样在冰上进行，加样完成后反应管直接从冰上转入预热到 94 ℃的循环仪加热模块或水浴中。对于放射性标记的反应，在反应开始前立即在 100μL 的反应混合液中加入 1 μCi [ 32 P] dCTP (Amersham, Arlington Heights, IL,USA) 。使用 100μL 、 25μL 、 6.2μL 反应体积得到的结果相同，对于小的反应体积，加样（尤其是 dNTP ）至关重要。实验中使用了各种 PCR 仪，经过细微调节后都得到了好的实验结果。 

PCR产物的凝胶分析 

   在 3%SeaKem ? LE 或 NuSieve ? (3:1) 琼脂糖凝胶 (FMC BioProducts, Rockland, ME, USA) 上对 X 、 Y 染色体上非多态性位点的 PCR 产物进行分离，电泳缓冲液分别为 1xTAE [0.04M Tris-acetate; 0.001 M EDTA (pH8.0)] 或 1xTBE [0.09 M Tris-borate; 0.002 M EDTA (pH 8.0)] 缓冲液，电泳在室温下进行，电场强度为 7–10V/cm 。 PCR 产物的上样体积相同，电泳后凝胶用 0.5–1 μ g/mL EB 染色。 

   当检测位点为多态性位点或需要更高的分辨率时使用测序胶 (6% 聚丙烯酰胺 [PAA]/7 M 尿素 ) 。与上样缓冲液混匀后，每泳道加入约 0.2 μ L 放射性标记的 PCR 产物。凝胶在 0.6xTBE 缓冲液中在 1800–2000 V (60A) 条件下电泳两小时。过夜曝光后得到自显影图像。 

结果与讨论 : 

   在大量实验的基础上，如 Figure1 所示设计出了多重 PCR 的标准方法，其中也包括了许多经常遇到的问题的解决方案。为了便于使用，用斜体字将步骤表与材料和方法中的各点及以下部分联系起来。