Single-cell RT-PCR

单细胞RT-PCR技术创立于1991年，随着时间发展，其技术不断完善，在神经生物学、胚胎发育、免疫学等领域都有进一步发展。

1. 单细胞的获得

第一步是获得单个完整的细胞，注意：快速精确操作，尽量减少在操作中由于外界刺激和时间过长引起的细胞表达上的改变，以及外源RNA和RNA酶的污染；目前常用方法有膜片钳技术，激光显微切割技术（LCM），显微吸管操作和流式细胞仪（FACS）。

膜片钳技术是在单细胞RT-PCR 中最早使用也是最成熟的一项技术，且广泛用于神经生物学上。而在非神经细胞的研究当中，主要用到的是后面的三种方法。激光显微切割技术和显微吸管操作都则用到倒置显微镜：如果细胞在异源性组织中且无法用显微镜直接辨别，就必须先用免疫标记的方法对细胞标记；如果细胞处在同源性组织中或者是体外培养，就可以直接进行操作。而对于流式细胞仪来说，细胞必须先进行免疫标记。

2. 单细胞的裂解

单细胞裂解多采用化学裂解的办法，裂解液中含有RNAse 抑制剂以及一定浓度的蛋白变性剂（如1%，0.5%,0.4%的NP40，2.5%的Triton等），常温裂解或者冰冻解冻的循环裂解。多细胞裂解之后，要进行一步分离提纯才进行RT-PCR；目前市场上有一些裂解液可供选择：CelluLyser(TATAA生物中心)、Real-Time Ready Cell Lysis(罗氏)、Single Cell-to-CT(Life Technologies)等，除了化学方法外，也可以通过物理方法使单细胞破裂。2002 年武汉大学的几位实验者以拟南芥的胚胎细胞为材料，在倒置显微镜下，用微吸管吸取细胞，将细胞压紧反应器皿（Petri dish）的底部，研磨使细胞破裂并释放出大量的RNA。
 

3.  单细胞mRNA逆转录为cDNA

RT 的过程中，通常选用没有RNase 活性的、高效率的逆转录酶，单细胞RT 的反应体系较小，但通常在5ul-20u 内，且5-15ul居多。但是引物的浓度和dNTP 的浓度一般不会比多细胞的RT 体系(引物200U，dNTP 0.5mM)多。如果按照单位浓度dNTP/引物: 单位浓度模板来看，单细胞RT 体系还是比多细胞RT体系要大很多。使用大比例的引物有利于增大模板和底物结合的几率。

4 ，微量cDNA的进一步扩增

成功进行逆转录后，合成的cDNA 的拷贝数仍然是较少的。在PCR 阶段，与多细胞相似，酶离子浓度、退火温度和时间控制等都和模板及引物自身有关；多少RT 产物将用于进一步的PCR 过程是不一定的，主要和想要克隆的基因的丰度相关。其次，可以优化PCR 的条件也可以提高PCR 的效率：

（1）槽式PCR 和半槽式PCR，它们的原理都是进行两轮PCR，第一轮使用普通引物进行扩增，第二轮以第一轮扩增出的DNA 为模板，以槽式引物进行扩增。所谓槽式引物，是引物是和模板两端若干个碱基以内的序列配对。半槽式区别于槽式，主要是前者第二轮扩增的时候一端为普通引物，一端用槽式引物，后者都用槽式引物，槽式PCR 和半槽式PCR 可以大大提高扩增的效率和特异性，但是与此同时也大大加大了引物设计的难度。

（2）对于在细胞中拷贝不算太低的基因，可以增加PCR 的循环次数，一般到45-50 个循环。之后就到达平台期，扩增的DNA 量无法显著地提高了。

（3）每次循环后适当地增加延伸的时间和退火的温度，也有助于特异性和扩增效率的提高。

工作流程：（Single Cell-CT kit）