免疫组化方法（石蜡切片）

*重要提示：参考抗体说明书选用合适的抗体稀释液和抗原修复处理方法。IHC 方法：抗原修复缓冲液/抗体稀释液

A. 所需溶液和试剂

1. 二甲苯

2. 无水乙醇（100% 和 95%，变性无水乙醇，组织学级）

3. 去离子水（dH2O）

4. 苏木精（可选）

5. 漂洗（缓冲）液：

1X TBS/0.1% Tween-20 (1X TBST)：配制时，取 100 ml 10X TBS 加 900 ml 水稀释至 1 升。加入 1 ml Tween-20，混匀。

10X Tris 缓冲盐水 (10X TBS)：在 800 ml 蒸馏水中加入 24.2 g 三羟甲基氨基甲烷（Trizma base, C4 H11NO3）和 80 g 氯化钠（NaCl）。用浓盐酸将 pH 调节到 7.6，定容至 1 L。

6. 抗体稀释液

a. SignalStain? 抗体稀释液 #8112

b. TBST / 5% 正常山羊血清： 5 ml 1 X TBST 中添加 250 ?l 正常山羊血清。

c. PBST / 5% 正常山羊血清： 5 ml 1 X PBST 中添加 250 ?l 正常山羊血清。

1 X PBS / 0.1% Tween-20 (1 X PBST): 配制时，取 100 ml 10X PBS 加 900 ml 水稀释至 1 L。加入 1 ml Tween-20，混匀。

10X 磷酸盐缓冲液 (10X PBS): 在 800 ml 水中加入 80 g 氯化钠（NaCl）, 2 g 氯化钾（KCl）, 14.4 g 磷酸氢二钠（Na2 HPO4）和 2.4 g 磷酸二氢钾（KH2PO4）。调整 pH 到 7.4，定容至 1 L。

7. 抗原修复：

a. 柠檬酸盐：10 mM 柠檬酸盐缓冲液：称取 2.94 g 二水合柠檬酸钠（C6 H5Na3O7?2 H2O）溶解在 800 ml 水中。调整 pH 为 6.0，定容至 1 L。

b. EDTA: 1 mM EDTA: 称取 0.372 g EDTA (C10 H14N2O8Na2?2 H2O) 溶解在 800 ml 水中。调整 pH 为 8.0，定容至 1 L。

c. TE：10 mM Tris/1 mM EDTA, pH 9.0: 配制时，称取 1.21 g Trizma?碱（C4 H11NO3）和 0.372 g EDTA (C10 H14N2O8Na2?2 H2O) 溶解在 950 ml 蒸馏水中。调整 pH 到 9.0，然后用蒸馏水定容至到 1 L。

d. 胃蛋白酶：1 mg/ml，溶解在 pH 为 2.0 的 Tris 盐酸缓冲液中。

8. 3% 过氧化氢：配制时，将 10 ml 30% H2O2 加入到 90 ml 蒸馏水中。

9. 封闭液：TBST/5% 正常山羊血清：5 ml 1X TBST 中添加 250 ?l 正常山羊血清。

10. 检测系统：根据厂家说明书使用。已有的检测系统：

SignalStain? Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114SignalStain? Boost IHC Detection Reagent (HRP, Mouse) #8125注意: 如果本产品没有使用本试剂优化过，可能需要通过滴定法来确定最佳条件。

11. DAB 试剂或合适的底物：按产品说明配制。

B. 脱蜡处理/再水化

注意：操作中任何时候都不要晾干玻片

1. 脱蜡处理/切片的水化：

a. 用二甲苯浸洗切片 3 次，每次 5 分钟。

b. 用无水乙醇浸洗切片 2 次，每次 10 分钟。

c. 用 95% 乙醇浸洗切片 2 次，每次 10 分钟

2. 在蒸馏水中漂洗 2 次，每次 5 分钟。

C. *抗原修复

注意：参考抗体说明书选用合适的抗原修复缓冲液，按以下步骤操作。

1. 柠檬酸缓冲液处理：加热浸泡在 10 mM pH 6.0 的柠檬酸盐缓冲液中的玻片，使之维持在准沸腾的温度（95-99°C）10 分钟。取出放在实验台上自然冷却 30 分钟。

2. EDTA 处理：加热浸泡在 1 mM pH 8.0 EDTA 溶液中的玻片，使之维持在准沸腾的温度（95-99°C）15 分钟。不需另加冷却步骤。

3. TE 处理：加热浸泡在 pH 9.0 的 10 mM TE/1 mM EDTA 溶液中的玻片，使之维持在准沸腾的温度（95-99°C）18 分钟。取出放在实验台上自然冷却 30 分钟。

4. 胃蛋白酶处理：37°C 消化 10 分钟。

D. 染色

注意：查询产品说明书推荐的抗体稀释比例。

1. 切片用漂洗液洗两次，每次 5 分钟。

2. 浸泡在 3% H202 中孵育 10 分钟

3. 用蒸馏水漂洗两次，每次 5 分钟。

4. 用漂洗液洗 5 分钟

5. 在切片上滴加 100-400 μl 封闭液，室温封闭 1 小时。

6. 去掉封闭液，每个切片上加 100-400 ?l 稀释的一抗。4°C 孵育过夜。

7. 去掉抗体稀释液。用漂洗液洗 3 次，每次 5 分钟。

8. 根据厂家说明书，用合适的检测系统检测。

9. 用漂洗液洗 3 次，每次 5 分钟。

10. 加入 100–400 ?l DAB 或合适的底物，近距离检测染色进展。

11. 一旦切片染色成功，立刻将玻片浸入水中。

12. 如有需要，将切片泡在苏木精溶液中复染，按照产品说明进行。

13. 切片用蒸馏水洗两次，每次 5 分钟。

14. 切片脱水：

a. 在 95% 乙醇中孵育两次，每次 10 秒。

b. 在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 秒。

c. 在二甲苯中孵育两次，每次 10 秒。

15. 加上盖玻片。

免疫组化方法（冰冻切片）

A. 所需溶液和试剂

1. 二甲苯

2. 无水乙醇（100% 和 95%，变性无水乙醇，组织学级）

3. 苏木精（可选）

4. 固定剂：请参考产品说明书选取合适的固定剂。

a. 10% 中性福尔马林

b. 丙酮

c. 甲醇

d. 3% 甲醛溶液：配制时，将 18.75 ml 16% 甲醛溶液加入到 81.25 ml 1X PBS 中。

5. 10X Tris 缓冲盐水（10X TBS）：在 800 ml 蒸馏水中加入 24.2 g 三羟甲基氨基甲烷（Trizma base ，C4 H11NO3）和 80 g 氯化钠（NaCl）。用浓盐酸将 pH 调节到 7.6。

6. 漂洗（缓冲）液：1 X Tris 缓冲盐水（TBS）。100 ml 10 X TBS 加 900 ml 水至 1L。

7. 甲醇/过氧化氢：配制时，将 10 ml 30% H202 加入到 90 ml 甲醇中。保存在-20°C。

8. 封闭液：1X TBS / 0.3% Triton-X 100 / 5% 正常山羊血清。配制时，将 500 ?l 山羊血清和 30 ?l Triton-X 100 加入到 9.5 ml 1X TBS 中。

9. 检测系统：根据厂家说明书使用。已有的检测系统*。

10. DAB 试剂或合适的底物：按产品说明配制。

B. 切片

1. 对于保存在-80°C 的样品：切片前先从冰箱中取出放在-20°C 平衡 15 分钟左右。这可以避免切片时样品断裂。

2. 将样品切成大约 6-8 ?m 厚，铺在带正电性的玻片上。

3. 固定前，可以把切片摊开放在实验台上风干几分钟。（这有助于切片贴紧玻片）

C. 固定

注意：参考产品说明书（抗体）选择合适的固定剂

1. 玻片上的切片风干后，选用如下合适的固定剂进行固定。

a. 10% 中性福尔马林：室温 10 分钟。立即进行染色操作。

b. 冰丙酮：-20°C 10 分钟。风干。立即进行染色操作。

c. 甲醇：-20°C 10 分钟。立即进行染色操作。

d. 3% 甲醛溶液：室温 15 分钟。立即进行染色操作。

e. 3% 甲醛/甲醇：先在室温下 3% 甲醛中固定 15 分钟，然后在-20°C 的甲醇中固定 5 分钟（中间不漂洗）。立即进行染色操作。

D. 染色

1. 切片用漂洗液洗两次，每次 5 分钟。

2. 室温下，浸泡在 3% H202/甲醇中孵育 10 分钟

3. 用漂洗液洗两次，每次 5 分钟。

4. 在切片上滴加封闭液，室温封闭 1 小时。

5. 按抗体说明书的推荐比例将抗体稀释在封闭液中。

6. 去掉切片上的封闭液，每个切片上加 100-400 ?l 稀释的一抗。4°C 孵育过夜。

7. 去掉抗体。用漂洗液洗 3 次，每次 5 分钟。

8. 根据厂家说明书，用合适的检测系统*检测。

9. 用漂洗液洗 3 次，每次 5 分钟。

10. 加入 100–400 ?l DAB 或合适的底物，近距离检测染色进展。

11. 一旦切片染色成功，立刻将玻片浸入水中。

12. 如有需要，将切片泡在苏木精溶液中复染，按照产品说明进行。

13. 切片用蒸馏水洗两次，每次 5 分钟。

14. 切片脱水：

a. 在 95% 乙醇中孵育两次，每次 10 秒。

b. 在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 秒。

c. 在二甲苯中孵育两次，每次 10 秒。

15. 加上盖玻片