实验方法原理

     MTT 分析法以活细胞代谢物还原剂 3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3，5-di- phenytetrazoliumromide， MTT 噻唑蓝为基础。MTT 为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素 C 的作用下 tetrazolium 环开裂，生成蓝色的 formazan 结晶，formazan 结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将 MTT 还原）。还原生成的 formazan 结晶可在含 50% 的 N，N-二甲基甲酰胺和 20% 的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的 MTT 溶解液中溶解，利用酶标仪测定 490 nm 处的光密度 OD 值，以反映出活细胞数目。也可以用 DMSO 来溶解。

     MTT 粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。

     试剂、试剂盒

     10% 胎小牛血清   MTT 溶液   DMSO

     仪器、耗材

     96 孔板   离心机   酶联免疫   监测仪

     实验步骤

     步骤

     1、接种细胞

      用含 10% 胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔 1000－10000 个细胞接种到 96 孔板，每孔体积 200ul。

     2、培养细胞

     同一般培养条件，培养 3－5 天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。

     3、呈色

     培养 3－5 天后，每孔加 MTT 溶液（5 mg/ml 用 PBS 配）20ul. 继续孵育 4 小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加 150ul DMSO，振荡 10 分钟，使结晶物充分融解。

     4、比色

     选择 490nm 波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

     注意事项

     1、选择适当得细胞接种浓度。

     2、避免血清干扰：一般选小于 10% 的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。

     3、设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。

     MTT 实验吸光度最后要在 0-0.7 之间，超出这个范围就不是直线关系，

     IC50 是半抑制率，意思是抑制率 50％ 的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到 50％ 抑制率时候的药品浓度，就是 IC50。要点：药品 2 倍稀释，多做梯度，做点线图即可！