流式细胞仪（flow cytometer）是一种能够探测和计数以单细胞液体流形式穿过激光束的细胞检测装置，由于在检测中使用的细胞标志示踪物质为荧光标记物，因此，用来分离、鉴定细胞的流式细胞仪有被称为荧光激活细胞分类仪，是分离和鉴定细胞群及亚群的一种强而有力的应用工具。


实验方法原理

       流式细胞仪的使用一般分为三个步骤。

       第一，是仪器前阶段，包括试剂的准备，细胞制备、细胞的荧光染色；

       第二，是流式细胞仪阶段，主要是仪器的操作；

       第三，是结果分析阶段。

       实验材料 淋巴细胞外周血的白细胞

       试剂、试剂盒： FACS缓冲液PBS叠氮钠溶液仪器缓冲液FACS清洁液FACS洗净液

       仪器、耗材： 流式细胞仪

实验步骤

一、 细胞和试剂的准备


       1.  细胞样品：来源淋巴细胞或外周血的白细胞。


       2.  荧光标记单克隆抗体：常用的有FITC（fluorescein -isothiocyanate）和PE（phycoerythrin）标记的单克隆抗体。


       3.  封闭抗体：抗Fc受体抗体
 
       4.  FACS缓冲液：
       1×PBS  950 ml
       FCS  40 ml
       10%叠氮钠溶液  10 ml


       5.  仪器缓冲液（FACS-flow）：仪器厂家提供


       6.  FACS清洁液（FACS clean ）和FACS洗净液（FACS rinse）：仪器厂家提供。


二、操作步骤
 
       1.  单细胞悬液的制备：将1×105~1×107的细胞放入1.5 m l离心管中3000 r/min 离心5分钟，弃上清；加入FACS缓冲液100 μl 悬浮细胞。


       2.  封闭细胞表面Fc受体：在步骤1中加入Fc受体抗体0.5 μl（0.5 mg/ml），水浴3分钟。


       3.  细胞与荧光抗体结合：在步骤2中加入荧光抗体1 μl（0.5 mg/ml），水浴30分钟。


       4.  洗细胞去除游离的荧光抗体：在步骤3中加入FACS缓冲液350 μl，轻轻混匀，3000 r/min，离心5分钟，弃上清，重复步骤（4）2次。


       5.  上样前处理：取100 μl 仪器缓冲液加入步骤（4）获得的细胞沉淀中，轻轻混匀悬浮细胞，将细胞悬液移入FACS专用管中，准备进行仪器检测和分析。


三、仪器的操作


       以FACSCaliburTM（BD Biosciences）仪器为例。仪器主要分为主机部分（包括激光激活源，射流，射线探测器）和计算机部分（CELLQuest softwere）。仪器的操作分为使用前的准备、使用中的操作和使用后的清洗。


1.使用前的准备


       （1）打开电源：包括系统电源和主机部分电源。


       （2）检查供液槽和废液槽：供液槽应含足够的仪器缓冲液，废液槽应在上次使用后清洗干净。


       （3）使机器处于负亚状态，才能使细胞悬液被吸入至机器的吸管口。


       （4）机器处于可应用状态时，指示灯会变成绿色。


2.使用中的操作


       （1） 计算机部分—使用CELLQuest程序系统软件：


       ①设定所要检测细胞的数量：一般设10 000~20 000个细胞。


       ②命名本次实验：一般含使用者的姓名和实验日期。


       ③打开记数部分：显示进入的细胞数以及检测一定量的细胞所需要的时间。


       ④将微机与主机连接：控制检测时的预检测和实际检测。


       ⑤主机设定：一般是已设定好的适合测定淋巴细胞的条件，包括探测器的电压。探测器的电压是调空光电倍增管所能检测荧光密度的范围。


       ⑥选择检测的波长和表达方式（plot）：如果用一种荧光抗体，一般选直方图（histogram）；如果用两种荧光抗体，常选点状二维图（dot plot）或轮廓线图（contour plot）表


        CD69分子表达检测直方图的数值说明
 

 
       b.abti-CD3（2 ng/ml）检测结果
 

 
       c.abti-CD3（10 ng/ml）检测结果
 

 
       CD4及CD8细胞点状二维图结果
 

 
       不同的荧光物要求选择不同的激发波长，参见下表
 

 
       （2）细胞的吸入：将装有细胞的FACS测定管放置到机器吸管孔处。
先预检测样品，然后进行实际检测。可根据细胞的浓度选择测定的速度（低、中或高）。所有的数据将自动存入微机。


       3.使用后的清洗  所有样品测定完后，要进行仪器的清洗。


       （1）将装FACS清洁液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入1分钟。


       （2）将装FACS洗净液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入 1分钟。


       （3）再将装FACS清洁液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入5分钟。


       （4）同样再将装FACS洗净液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入5分钟。


       （5）最后将一装有双蒸水的FACS管放置机器吸管孔后，关闭机器。


       （6）将废液槽中的废液倒掉，并清洗干净废液槽。
 
注意事项
       1.  减少非特异荧光染色
       （1）细胞的活性和状态：流式细胞仪不但可探测细胞表面的荧光，也可探测细胞内的荧光。因此，如果要检测细胞表面的分子，一定要保证细胞的活性，还应尽可能保持细胞静止，通常在4度进行操作。否则，荧光抗体进入死细胞内，会产生非特异结果。


       （2）封闭抗体的应用是必不可少的，因为大多数的免疫细胞表面都表达有Fc-R。细胞与抗体相互作用后，一定要用FACS缓冲液洗2~3次，以除去游离的抗体。


       2.  单染色时以FACS最常用，FITC标记抗体荧光比较稳定而且价格合适。


       3.  如果同时要检测两种以上的分子，一定要选择不同波长的荧光所标记的抗体。
 
      （本文转载丁香通）