简化SSH法寻找差异表达基因
发布人：admin
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发布时间：2016-11-29
无论是从一个胚胎细胞分化为不同的组织器官，或者是从正常的组织突变为肿瘤组织，都可能涉及在同一基因组背景下不同基因的差异性表达。寻找差异表达的基因就有可能揭示细胞分化的机制或者肿瘤的成因，因而也就成为一项热门的技术。
寻找差异表达的基因有不少方法，抑制消减杂交（SSH）是比较有效的一种方法。以Clontech的pcr-Select cDNA Subtraction Kit为例：将样品（tester）和对照（driver）的mRNA分别反转录并合成为双链cDNA后进行酶消化；样品（tester）分为两组，分别加上不同的adaptor1/2；再将两组样品（tester）分别与过量的对照（driver）杂交，两份杂交结果混合，加入过量的对照再进行第二轮杂交；补齐adaptor然后用PCR选择性扩增。由于过量的对照封闭了在样品中共同表达的基因，而在样品中特异表达的基因会被选择性地扩增出来，这些扩增的片断经过克隆、测序后可以进行拼接或者用RACE的方法从已知片断钓全长cDNA，再做进一步的分析。
但是这一系列的操作并不简单，且得到的结果是一些基因片断，还需要进行下一步的拼接或RACE才能得到完整的基因信息，现在介绍一种简化的消减杂交的技术：以Miltenyi Biotec公司的μMACS mRNA Isolation Kit为例，在纯化（driver）mRNA时先将组织裂解，加入耦联了Oligo dT的磁珠悬液，混匀并立即加入放在磁场中的磁式分离柱中，磁珠上的Oligo dT有效吸附mRNA并悬浮在磁场中，其它杂质随溶液流出。加入新鲜的wash buffer反复淋洗干净挂上mRNA的磁珠后，不用洗脱液洗脱mRNA，而是利用磁珠上的Oligo dT作为RT引物直接进行反转录反应，再用Elution buffer洗脱mRNA，得到耦联在磁珠上的对照单链cDNA库。这时将样品（tester）的mRNA加入磁珠中，共同表达的基因对应的mRNA被磁珠上的cDNA吸附留在磁场中而特异表达的mRNA不被吸附随溶液流出柱外，这部分溶液反复过柱后得到的就是差异表达的mRNA。其它的mRNA分离试剂也可有类似的用法，只是本文介绍的方法由于得到的mRNA纯度高、完整且浓度高体积小，又是层析柱式的逐级淋洗使cDNA与mRNA吸附得更充分，所以假阳性较少。
这种方法得到的是全长的mRNA，可以直接得到全长的cDNA而无需拼接DNA片断，且操作也较为简单。至于效率或假阳性率则因人而异了。
