DNA原位核酸杂交方法
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发布时间：2017-11-17
一、地高辛（Dig）标记DNA探针在石蜡切片上的检测方法
1. 组织切片的预处理
（1）固定：组织以10%中性福尔马林液，常规石蜡包埋，切片厚4-6 μm，最好用硅化玻，60℃烤片6-8 h。
（2）脱蜡至酒精。
（3）入0.2 mmol/L HCl 20 min 去除蛋白。
（4）50℃2×SSC，含5 mmol/L EDTA溶液中30 min。
（5）蛋白酶K（1 μg/ml 溶于0.1 mol/L PBS中），37℃20-25 min。
（6）0.2 mol/L 甘氨酸液：室温10 min，中止蛋白酶反应。
（7）4%多聚甲醛（PBS新鲜配制），室温20 min。
（8）PBS/5 mmol/L MgCl2漂洗10 min×2。
（9）脱水，从低浓度到高浓度至无水乙醇，空气中干燥。
2. 预杂交
加预杂交液20 μl/每张切片，42℃水浴半小时（封闭非特异性杂交位点）。
3. 杂交
加杂交液20 μl/每张切片，加盖硅化盖片，将切片置于95℃10 min，使探针变性，DNA双链解成单链，然后迅速置于冰上1 min，再将切片置于盛有2×SSC湿盒内，37-42℃过夜（16-18 h）。有条件也可用原位杂交仪进行变性和杂交。
4. 杂交后漂洗
（1）2×SSC液内振动移除盖片。
（2）2×SSC55℃5 min×2。
（3）0.5×SSC50℃5 min×2。
（4）缓冲液Ⅱ（含0.5%封阻试剂，用缓冲液Ⅰ溶解）37℃30 min。
（5）缓冲液Ⅰ（100 mmol/L Tris-HCl，15.0 mmol/L NaCl pH7.5）15 min，室温。
（6）酶标地高辛抗体（1∶5000，用缓冲液Ⅰ稀释）37℃30 min。
（7）缓冲液Ⅰ15 min×2，室温。
（8）缓冲液Ⅲ（100 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，50 mmol/L MgCl2，pH9.5）室温，2 min。
5. NBT/BCIP显色，显微镜下进行观察。水洗，核固红复染，脱水封片。
6. 结果
杂交阳性信号呈紫兰色，细胞核呈红。（转帖）
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