实验方法原理
采用粘末端连接必须对目的DNA分子和载体分子进行酶切以获得相应的粘末端进行连接。酶切可以是单酶切也可以是双酶切。单酶切操作比较简单，但双酶切如果两种酶所用缓冲液成分不同（主要是盐离子浓度不同）或反应温度不同，这时可以采用如下措施解决：1）先用一种酶切，然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另外一种酶切；2）先进行低盐要求的酶酶切，然后添加盐离子浓度到高盐的酶反应要求，加入第二种酶进行酶切；3）使用通用缓冲液进行双酶切。具体要根据酶的反应要求进行，尽量避免星号活力。
实验材料 质粒DNA
试剂、试剂盒 限制性核酸内切酶蒸馏水
仪器、耗材 微量移液枪离心机电泳仪水浴锅紫外透射观测仪离心管记号笔
实验步骤
一、实验材料准备
1. 材料：质粒DNA。
2. 试剂：限制性内切酶、ddH2O。
3 . 仪器：微量移液枪，离心机，水浴锅， 电泳仪，紫外透射观测仪。
二、单酶切
1. 在1.5 mL灭菌离心管中依次加入：
（1）质粒DNA：X μL（约1 μg）。
（2）限制性内切酶：1 μL（约10 U）。
（3）10×buffer：2 μL。
（4）ddH2O：补足20 μL。
2. 混匀，做好标记。
3. 37℃水浴1-3 h。
4. 70℃水浴10 min中止反应。
5. 电泳检测酶切效果。
三、双酶切
1. 在1.5 mL灭菌离心管中依次加入：
（1）质粒DNA：X μL（约1 μg）。
（2）限制性内切酶1：1 μL（约10 U）。
（3）限制性内切酶2：1 μL（约10 U）
（3）10×buffer：1或2 μL。
（4）ddH2O：补足20 μL。
2. 混匀，做好标记。
3. 37℃水浴1-3 h。
4. 70℃水浴10 min中止反应。
5. 电泳检测酶切效果。
四、结果与分析
假若一种酶在环状质粒DNA中只有一个酶切位点， 且酶切彻底，紫外灯下检测电泳结果，则单酶切应为一条带， 而双酶切则为两条带。如果条带数目多于理论值，那么有可能是酶切不完全。如果酶切结果与酶切前的质粒条带一样（超螺旋、线性和开环三条带），则说明质粒完全没有被切开。
注意事项
1. 酶切的选择原则一般是尽量扩大酶切体系，这样抑制因素得以稀释；基因组DNA或质粒DNA酶的用量较一般DNA大，一般为1μg/10U；所加酶的体积不能超过酶切总体积的1/10，否则甘油浓度会超过5%，会产生星号活力；对难切的质粒或基因组DNA应延长反应时间4―5hr， 甚至过夜。灭活限制性内切酶活性可以采用加热灭活，乙醇沉淀，酚/氯仿抽提，添加EDTA或SDS等方法，具体每一种酶可能有些方法不能完全灭活，这一点需要注意。
2. 双酶切体系缓冲液添加量要根据两种限制性内切酶最佳缓冲体系，可以登录限制性内切酶购买公司官方查看。（转帖）
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