质粒DNA提取及琼脂糖凝胶电泳检测
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发布时间：2016-11-12
一、碱变性法提取质粒DNA
质粒(Plasmid)是细菌染色体外能自身独立复制的双股环状DNA。带有遗传信息，可赋予细菌某些新的表型。将质粒指纹图谱分析方法、质粒 DNA探针技术及检测质粒的pcr技术用于临床感染性疾病的诊断和流行病学调查已成为现实。质粒作为载体在基因工程中起着重要的作用。
分离和纯化质粒DNA的方法很多,但这些方法基本包括三个步骤：即细菌的培养和质粒DNA的扩增；细菌菌体的裂解;质粒DNA的提取与纯化。
本实验学习用碱变性方法提取质粒DNA 。
【原理】
细菌培养物加入SDS和NaOH碱性溶液处理后，菌体裂解，可使细菌的质粒DNA、染色体DNA和RNA一起从细胞内释放出来，经琼脂糖凝胶电泳，因各种核酸分子的迁移率不同将上述核酸分成不同的带。用溴化乙锭（EB）染色后，在紫外线灯下可看到各种核酸带发出的荧光。根据荧光的位置，可区分不同的核酸带。
【材料】
1、菌株E.coliJM109（pUC19），E.coliRRI（pBR322）
2、试剂溶液Ⅰ(50mM葡萄糖,25mMTris.HclPH8.0,10mMEDTA)
溶液II(0.2NNaOH，1%SDS)用前新配制
溶液III(5mMKAc溶液，PH4.8)
TE缓冲液(10mMTris.Hcl,1mMEDTA，PH8.0)
LB液体培养基(胰蛋白胨10g，酵母粉5g,Nacl10g，加蒸馏水溶解，用NaOH调PH至7.5，加水至1000ml，15磅高压灭菌15分钟。)
【方法】
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二、琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳技术（Agarosegelelectroghoresis）是分离、鉴定和提纯DNA片断的有效方法。凝胶分辨率决定于使用材料的浓度，并由此决定凝胶的孔径。琼脂糖凝胶可分辩0.1~6.0kb的双链DNA片段。琼脂糖凝胶电泳是一个电场作用。它首先利用琼脂糖的分子筛效应，此外，在弱碱性条件下，DNA分子带负电荷，从负极向正极移动。根据DNA分子大小、结构及所带电荷的不同，它们以不同的速率通过介质运动而相互分离。借助溴化乙锭（EB）能与双链DNA结合的作用，利用EB染色，并通过紫外线激发即可观察被分离DNA片段的位置。
【材料】
1、琼脂糖、10×TAE电泳缓冲液（40mMTris,20mMNaAc,1mMEDTA，PH8.0）
2、载体缓冲液（0.25%溴酚蓝，30%甘油）、溴化乙锭水溶液（10mg/ml）
3、凝胶槽、电泳仪
