1、基于胚胎干细胞打靶的基因敲除与基因敲除小鼠

所谓基于胚胎干细胞打靶的 “基因敲除小鼠、基因敲除模式小鼠”，就是先在小鼠的胚胎干细胞上通过基因重组的办法进行基因修饰——将胚胎干细胞中的靶向基因改掉，然后将“修饰”后的胚胎干细胞植入小鼠的早期胚胎，生成嵌合体小鼠-基因敲除小鼠，基因敲除模式小鼠。这种嵌合体小鼠——基因敲除小鼠，基因敲除模式小鼠长大后，体内同时存在被“修饰”过的基因和未被“修饰”的基因。当小鼠的生殖细胞恰巧被“修饰”过了，则它们就会生出基因完全被“修饰”过的基因敲除小鼠，基因敲除模式小鼠。

基因敲除（Gene knock-out），是建立在基因同源重组技术以及胚胎干细胞技术基础上的一种新分子生物学技术。基因敲除技术是对一个基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其它基因取代，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能的一种技术。它克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。这项技术的诞生可以说是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革命。尤其是条件性、诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因靶位时间和空间上的操作更加明确、效果更加精确、可靠，它的发展将为发育生物学、分子遗传学、免疫学及医学等学科提供了一个全新的、强有力的研究、治疗手段，具有广泛的应用前景和商业价值。

基因敲除除可中止某一基因的表达外，还包括引入新基因及引入定点突变。既可以是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。

2、上海中洪博元生物技术公司基因敲除模式小鼠制备技术

2.1打靶载体的构建

1.打靶载体的设计及构建：打靶载体的设计及构建是基因敲除小鼠、基因敲除模式小鼠开发的第一步。是把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因(如neo基因，TK基因等)的载体上，此重组载体即为打靶载体。因设计与开发基因敲除小鼠、基因敲除模式小鼠目的不同，此载体有不同的设计方法，可分为替换性载体和插入型载体。如为了把某一外源基因引入染色体DNA的某一位点上，这种情况下应设计的插入型载体要包括外源基因(即目的基因)、同源基因片段及标记基因等部分。如为了使某一基因失去其生理功能，这时所要设计的替换型打靶载体，应包括含有此靶基因的启动子及第一外显子的DNA片段及标记基因等诸成分。此外，还要对Southern转染探针进行设计、构建、预实验及优化等。

上海中洪博元生物技术有限公司具有独特的、用于大片段DNA分子克隆技术并优化了一套独特的打靶载体构建技术，该技术可以大大地提高打靶载体构建速度，减少突变，同时易于胚胎干细胞重组和筛选等多重优点。使得公司的基因敲除小鼠，基因敲除模式小鼠模型构建速度大大加快。

2.2胚胎干细胞的电转和培养

小鼠胚胎干细胞（Embryonic stemcell, ESC）是基因敲除小鼠，基因敲除模式小鼠制备的关键材料。目前市场上供应的ES细胞通常质量很不稳定，或是同源重组效率不高，或是不容易进入种系传代，难于满足制备基因敲除小鼠，基因敲除模式小鼠的要求。实验室需要对ES细胞进行系统的研究试验，才能找到重组率高，易传代的ES细胞。我们公司自己研发并筛选C57BL/6遗传背景的小鼠胚胎干细胞，所以可以直接得到C57BL/近交系模式小鼠，省去用129背景小鼠所需要的超过2年的回交时间。

将基因打靶载体通过电穿孔法导入同源的C57BL/6胚胎干细胞中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将打靶载体中的DNA序列整合到内源基因组中从而得以表达。可以极大地缩短科研时间（7-9个月，节约一半的时间），节省资金，及提高科研的竞争力。由于其遗传背景清晰，容易获得重复性好的实验结果。

2.3阳性克隆的挑取和筛选：用选择性培养基筛选已击中的细胞：一般地，筛选使用正、负选择法，比如用G418筛选所有能表达neo基因的细胞，然后用Southern进行确认。将筛选出来的靶细胞导入鼠的囊胚中，再将此囊胚植入假孕母鼠体内，使其发育成嵌合体小鼠。

2.4通过观察基因敲除小鼠，基因敲除模式小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。基因敲除小鼠，基因敲除模式小鼠已经成为国内外科研机构、医药企业、医院进行基础研究的重要工具。