实验操作流程：

       1、取双肾，置于冷的PBS中；

       2、去除肾蒂和包膜，在体式显微镜下切除肾皮质；

       3、将肾皮质剪碎，移入EP管中，PBS洗3次；

       4、清洗完毕，沉淀用1g/LⅠ型胶原酶，37℃，30min消化；

       5、加入3倍体积的完全培养基终止消化；

       6、将细胞悬液过80目筛；

       7、收集悬液，200目筛、1000rpm.离心5min；

       8、沉淀用45％percoll分离液制备25ml悬液；

       9、悬液置于5ml 100%percoll上，14000rpm，4℃，离心25min.;

       10、分层，选择倒数第二层细胞悬液；

       11、得到近端肾小管上皮细胞，用DF12+10%FBS+双抗铺板

注意事项：

       鼠龄要选小一些的，我们一般选2周内的，这样细胞生长活性更好

Q：为什么我取得原代肿瘤组织，分离的却不是肿瘤细胞？

A：取材时，我们要熟悉所需组织的类型和部位特征，选择肿瘤细胞集中、活力较好的部分。避免结缔等正常组织。

Q：若是细胞中混成纤维细胞，如何去除？

A：成纤维细胞的去除对于肿瘤细胞培养十分重要。由于成纤维细胞贴壁速度较肿瘤细胞快，可利用反复贴壁法使二者分离，进而达到清除成纤维细胞的目的。

Q：为什么离心后，没有细胞分离出来？

A：需要考虑消化酶的因素，由于肿瘤组织较致密，胰酶无法消化，一般选用胶原酶，如胶原酶Ⅳ。若是组织十分致密可以再结合机械法，如研磨或者搅拌加速细胞分散。如下表为二者的区别：

注：胶原酶分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝细胞专用胶原酶，根据分离的组织类型需选择合适的胶原酶类型。

Q：消化时间如何确定？

A：具体的消化酶的量和消化时间可根据组织类型和多少进行调整。

Q：消化之前为什么用EDTA?

A：EDTA是一种非酶消化物，又称螯合剂，对一些组织，尤其是上皮组织分散效果好。与细胞上的钙、镁离子结合形成螯合物后，形成的机械力可使细胞分散。