利用 RNA 模板通过反转录获得 DNA,进而复制和感染细胞

实验材料
      poly(A)+RNA   反转录酶   鼠源反转酶 或禽源反转录酶

试剂、试剂盒
      oligo(dT)12-18   lmol LTris-Cl   1mol LTris-Cl   lmol LKC1   25 mmol LMgCl2   dNTP 混合物   0.lmol LDTT   RNasin


实验步骤
一材料与设备


      1)poly(A)+RNA,lmg/ml


      2)oligo(dT)12-18,lmg/ml


      3)lmol/LTris-Cl（pH7.6)。


      4)1mol/LTris-Cl(pH8.3)


      5)lmol/LKC1


      6)25 mmol/LMgCl2


      7)dNTP 混合物，各 5 mmol/L


      8)0.lmol/LDTT


      9)RNasin。


      10) 反转录酶，鼠源反转酶 (Pharmacia 公司，200U/ul) 或禽源反转录酶（20U/ul)

二、操作方法

(一) 使用鼠源反转录酶合成 cDNA


       1) 在灭菌微量离心管中混合下列物质，并置于冰上:


        Poly(A)+4RNA,lmg/ml                                          10ul


        oligo(dT)12-18,lmg/ml                                         10ul
 
 
         lmol/LTris-Cl(pH7.6)                                            2.5ul


         lmol/LKC1                                                          3.5ul


         250 mmol/LMgCl2                                               2ul


         dNTP 混合物，各 5 mmol/L                                 10ul


         0.lmol/LDTT                                                       2ul


         RNasin                                                              25U


         鼠源反转录酶                                                    200U


         加水至总体积为                                                 50ul


        2) 于 37°C 反应 lh


        3) 纯化回收. 保存于一 20℃


(二）使用禽源反转录酶合成 cDNA
 
        1) 在火菌微量离心管中混合下列物质，井置于冰上:

         poly(A)+RNA,lmg/ml                                             10ul


         oligo(dT)12-18,lmg/ml                                           10u1


         lmol/LTris-Cl(pH8.3)                                              2.5uI


         lmol/LKC1                                                            3.5ul


         250 mmol/LMgCI2                                                 2ul
 
 
         dNTP 混合物，各 3 mmol/L                                    10ul


         0.lmol/LDTT                                                          2ul


         RNasin                                                                  25U
 
 
         禽源反转斌酶                                                         40U
 
 
         加水至总体积为                                                     50ul

        2) 于 42℃ 反应 lh

        3) 纯化冋收，保存于一 20℃
 
注意事项
      1) 可以先进行小规模的预实验以确定反转录酶的用量。
 
      2) 在反应中加入 [α32P]dCTP，可以通过放射性自显影检测反转录的质量和产率

      3) 对于具有不利于转录反应的二级结构的 mRNA 的转录，使用最适温度为 42℃ 的禽源反转录酶可能取得较好的结果。

      4）除使用 oligo(dt)12-18 外，在反转录反府中也可以使用长度为 6 的随机寡聚核苷酸。
 
      5) 随若基因芯片技术的发展和逐渐普及应用，产生了由 mRNA 反转彔而获得荧光标记 cDNA 探针的方法。与常用的 RNA 探针同位素标记不同之处就在于其加入了荧光染料 Cy3 或 Cy5 代替了冋位素标记的 dNTP。

     （本文转载丁香园）