某些标记探针必须经纯化后方可使用。这是因为在探针标记过程中,反应液中仍存在一些未被结合到探针中去的剩余dNTP等小分子。
为将掺入并结合到cDNA,cRNA和标记寡核苷酸与游离的标记寡核苷酸分开,常使用乙醇沉淀法或酚/氯仿抽提法进行纯化。
乙醇沉淀法的原理是:DNA可被乙醇沉淀,而未掺入DNA的dNTP则保留在上清液中,由此反复乙醇沉淀能将两者分开。
核酸溶液中去除蛋白质的酚/氯仿抽提法的原理是:交替使用酚,氯仿这两种不同的蛋白质变性剂,以增加去除蛋白质杂质的效果。
因为酚虽能有效地变性蛋白质,但它不能完全抑制RNA酶的活性,而且酚能溶解10-15% 的水,从而溶解一部分ploy(A)RNA。
为克服这两方面的局限,混合使用酚与氯仿,对于RNA提取,显得更加重要,氯仿还能加速有机相与液相分层,去除植物色素和蔗糖。
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