NA标记是将标记物(如放射性同位素、荧光素或酶)共价地连接到RNA,通过检测标记物,进而实现对RNA鉴别和检测的目的。RNA标记在分子探针领域应用广泛,在疾病诊断方面也很有前景。
理想的RNA标记方法应符合以下要求:
1. 操作简单,灵敏度高
2. 不影响碱基配对的特异性
3. 不影响RNA活性
4. 对酶促反应活性无影响或影响不大
5. 检测方法具有高度灵敏性和高度特异性
6. 标记物对人体无害
RNA标记方法:
按反应机制分如下四类:直接标记法,加尾标记法,基于逆转录反应的标记方法,基于RNA克隆扩增的标记方法。
常用于RNA标记的方法按标记物性质分为:
放射性同位素标记:32P、35S、3H
非放射性标记:半抗原荧光素化学发光物质
地高辛
地高辛标记RNA常用的方法是将DIG与UTP共价结合形成DIG-UTP,以DIG-UTP、ATP、CTP、GTP为底物通过RNA聚合酶T7、SP6经体外转录合成标记RNA。此法多用于RNA探针的制备,一般每20~25个核苷酸可引入一个地高辛分子。5'末端标记法5'末端标记法是通过化学方法将地高辛标记于寡核苷酸的5'末端。首先在5'末端连接上一个氨基连接臂残基,将合成的寡核苷酸纯化后,再使DIG-NHS与5'末端的氨基残基发生共价结合,从而形成标记RNA。DIG-RNA5'3'5'3'DIGAnti-DIG-APAP-DIG-RNA5'3'5'3'X光片曝光化学发光信号蓝紫色
生物素
用生物素标记RNA的方法常见的是用生物素与UTP结合形成Biotin-UTP,以Biotin-UTPATP、CTP、GTP为底物通过RNA聚合酶SP6、T7等经体外转录合成标记RNA。
荧光素
目前常见的荧光染料包括:异硫氰酸荧光素(FITC)四甲基异硫氰酸罗丹明四乙基罗丹明得克萨斯红藻红蛋白(PE)花青类染料(Cy3、Cy5)新型荧光素如量子点(半导体纳米晶体)。