贴壁细胞免疫荧光(间接染色) 方法
发布人：admin
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发布时间：2016-11-30
材料和试剂
1. 圆形盖玻片 (Fisher)
2. DPBS (Invitrogen)
3. FBS (Atlanta)
4. 抗褪色封固剂: 如 ProLong Gold antifade reagent from Invitrogen, with DAPI (if need nuclear staining) or without DAPI.
5. 多聚甲醛 (Sigma)
6. 常用化学试剂 (Sigma)
实验步骤
1. 让细胞生长在放入24孔细胞培养板中的圆形盖玻片上，使其融合度达到30-60%，不要使细胞长过，如果长过会在染色时难以区别细胞的组分。
2. 每孔用500ulDPBS洗细胞2次，之后每孔加250ul 4% 多聚甲醛，室温固定15min
3. 去除多聚甲醛，每孔用500 ul含3%FBS 的PBS洗细胞3次
4. 每孔用250ul含0.2%Triton X-100 的DPBS透化细胞5 min，每孔用500 ul含3%FBS 的PBS洗细胞3次
5. 每孔加入500ulDPBS（含3%FBS和0.5% Tween20），室温封闭1小时。
6. 去除封闭液，每孔加250 ul一抗，室温孵育1小时
7. 去除抗体，每孔用500 ul含3%FBS 的PBS洗细胞3次，每次5min
8. 每孔加250 ul 荧光二抗，室温孵育30 min.
9. 去除二抗, 每孔用500 ul含3%FBS 的PBS洗细胞3次，每次5min
7. 载玻片上滴一小滴抗褪色剂，将盖玻片从孔中取出，面朝下盖到抗褪色剂上，使其轻轻接触到载玻片上。将玻片置于暗处5min使其晾干，此时即可在荧光显微镜下进行观察。
配液
1. 4%多聚甲醛（现用现配）(5ml): 0.2g 多聚甲醛粉末+ 5ml DPBS + 50ul 1MNaOH, 65℃孵育, 反复涡旋使其完全溶解, 室温冷却， 加 4ul HCl, 充分混匀
2. 抗体, 用 DPBS （含 3%FBS和0.5 Tween20）稀释
一抗: 1:100-1:500（不同的抗体稀释比例不同） ，
荧光二抗: 1:800.
