一、脱蜡和水化

      方法同SP法。

二、第一抗体的染色

      1、将切片浸在3%H2O2甲醇溶液（新鲜配制）中10min，PBS冲洗3min×3次；

      2、加100ul（2滴）血清封闭溶液（试剂1）到切片上，室温孵育10min，倒掉（不能冲洗）；

      3、加入一抗（按照说明书推荐浓度和孵育条件）；

      4、使用含有0.05%吐温20的PBS（TPBS），冲洗5min×3次；

      5、加入100ul（2滴）生物素化的二抗（试剂2)，室温孵育10min；

      6、用TPBS冲洗5min×3次；

      7、加入100ul（2滴）链霉亲和素-AP（试剂3）的二抗，室温孵育10min；

      8、用TPBS冲洗5min×3次；

      9、准备底物溶液：将1滴试剂4A和4B加入到1ml去离子水中，充分混匀。再加入1滴试剂4C，充分混匀；

      10、加100ul（2滴）配好的AP底物溶液，室温孵育（镜下掌握孵育时间）；

      11、使用含有0.05%吐温20的去离子水冲洗终止反应。

三、第二抗体的染色

      12、加100ul（2滴）双染增强剂（试剂7），孵育；

      13、用TPBS冲洗3min×3次；

      14、加100ul（2滴）血清封闭溶液（试剂1）到切片上，室温孵育10min，倒掉（不能冲洗）；

      15、加入稀释好的一抗（按照说明推荐浓度和孵育条件）；

      16、用TPBS冲洗5min×3次；

      17、加入100ul（2滴）生物素化的二抗（试剂2)，室温孵育10min；

      18、用TPBS冲洗5 min×3次；

      19、加入100ul（2滴）链霉亲和素-HRP（试剂5）的二抗，室温孵育10min；

      20、用TPBS冲洗5min×3次；

      21、准备底物溶液：将1滴试剂6A和6B加入到1ml去离子水中充分混匀。再加入1滴试剂6C，充分混匀；

      22、加100ul（2滴）配好的HRP底物溶液，室温孵育（镜下掌握孵育时间）；

      23、使用含有0.05%吐温20的去离子水冲洗终止反应；

      24、使用复染试剂染色（根据需要选择）；

      25、封片剂（试剂8）封片，显微镜观察并拍照。

  （本文转载丁香园）