一、实验目的：

  单克隆抗体制备是细胞免疫学的一个重要里程碑，它涵盖了细胞培养、细胞融合、免疫动物和抗体效价检测等各个方面内容。了解单克隆抗体制备的原理、主要步骤和方法。

二、实验原理：

  骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；而抗原免疫的B淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。经在HAT培养基[含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中进行选择性培养，未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡；未融合的骨髓瘤细胞合成DNA的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断，又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶（HGPRT），不能利用培养基中的次黄嘌呤完成DNA的合成过程而死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，因此能在HAT培养基中存活和增殖。经过克隆选择，可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培养，即可无限制地大量制备单克隆抗体。

三、试剂与器材：

  细胞培养板、解剖器械、平皿、酶标仪、加样器、细胞计数板、CO₂培养箱、倒置显微镜等。

四、操作方法：

  1、抗原制备；

  2、免疫动物；

  3、免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备；

  4、细胞融合；

  5、杂交瘤细胞的选择培养；

  6、杂交瘤细胞的筛选；

  7、杂交瘤细胞的克隆化；

  8、单克隆抗体的检定；

  9、分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立；

  10、单克隆抗体的大量制备。

五、关键步骤与注意事项：

  1、整个制备过程需严格无菌

  2、细胞传代培养时注意适时更换培养液

  （本文转载丁香园）