PCNA步骤
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发布时间：2016-12-12
PCNA步骤跟一般的免疫组化步骤基本一样：
1、脱蜡、水化
1) 60 ℃×20 min→Xylene 2 ×10 minutes；
2) 100% absolute ethanol：2 ×5 minutes；
3) 95% ethanol 2 minutes；
4) 80% ethanol 2 minutes；
5) 70% ethanol 2 minutes；
6) PBS洗3次×3 min
7）封闭内源性过氧化物酶： 3%的过氧化氢，室温封闭10min
9) PBS溶液洗3次×3 min。
3、抗原修复暴露抗原决定族
10) 切片放入0.01 M柠檬酸钠缓冲溶液（pH6.0）后，在微波炉里高火4 min至沸腾后，再加热约6 min×4次，每次间隔补足液体，防止干片。
4、封闭非特异性蛋白
11) PBS溶液洗3次×3 min；
12) 将切片取出,周围水分用滤纸吸干,用组化笔在组织周围画上圈,在圆圈内组织滴入5%羊血清（与二抗来源一致）后放入湿盒中,室温30（10～30）min；
5、一抗孵育
13) 甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入已稀释的一抗后，放入湿盒中室温1小时，然后4度过夜，从冰箱中取出需37 ℃复温45 min。
6、二抗孵育
14) 将一抗倒掉并用PBS洗5 min×5次；
15) 用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放入37 ℃恒温烤箱中30 min（回收）。
16) 用PBS洗5次×5 min；
7、SP反应
17) 加入SP后放入37度烤箱中30 min。
18) 用PBS洗5次×5 min；
8、显色
19) 加入DAB（快速滴入，观察染色情况，倒掉染液），显色时间控制在约5 min（3～10 min），由镜下观察颜色控制时间。
9、复染、脱水、透明、封片
20) 用PBS 3次×3min后，用双蒸水洗5 min；
21) 加一大滴苏木素染液，胞核蛋白染几秒，胞浆或胞膜蛋白染20 s后自来水冲洗，双蒸水洗5 min，再用PBS返蓝5 min。
22) 脱水：
70% ethanol 1-2 min
95% ethanol 1-2 min；
95% ethanol 1-2 min；
100% absolute ethanol: (1-2) min；
100% absolute ethanol: (1-2) min。
23) 透明：Xylene 1×(1-2) min→Xylene 2×(1-2) min
24) 封片：中性树胶。
