各种微生物在代谢类型上有时会表现出很大的差异。由于细菌特有的单细胞原核生物特性，这种差异就表现得更加明显。不同细菌具有不同的酶系统，故不同细菌分解、利用糖类、脂肪类和蛋白类物质的能力表现不同，它们对物质的代谢谱和分解产物也就不同，利用这种特点建立细菌生化反应，在菌株的分类鉴定中具有主要意义。

【实验目的】

     1. 了解细菌鉴定中常用的生理生化试验反应原理。

     2. 掌握测定细菌生理生化反应的技术和方法。

【实验原理】

     各种细菌由于具有不同的酶系统，致使它们能利用不同的底物，或虽然可以利用相同的底物，却产生不同的代谢产物，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别细菌。

【试剂与器材】

     1. 菌种　大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的斜面菌种

     2. 培养基　葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖或蔗糖）

     3. 试剂　百分之四十NaOH溶液、肌酸、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、溴甲百分之一点六基酚紫指示剂。

     4. 器具　超净工作台、恒温培养箱、高压灭菌锅、试管、移液管、杜氏小套管。

     5. 流程　糖发酵试验→V-P试验→甲基红试验→吲哚试验。

【实验方法与步骤】

     1. 糖发酵实验

     ① 试管标记　取分别装有不同糖类（如葡萄糖、蔗糖和乳糖等）发酵培养液的试管，根据需要培养的细菌做好标记（如大肠埃希菌、产气肠杆菌、普通变形菌等和空白对照）。

     ② 接种培养　以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中，空白对照中不接种，置37℃恒温箱中培养，分别在培养24h、48h和72h观察结果。

     ③ 观察记录　培养后各发酵管与空白对照相比，若接种培养液保持原有颜色，其反应结果为阴性，表明该菌不能利用该种糖，记录用“－”表示；如培养液呈黄色，反应结果为阳性，表明该菌能分解该种糖产酸，记录用“＋”表示。培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，表明该菌分解糖能产酸并产气，记录用“＋”表示；如杜氏小管内没有气泡为阴性反应，记录用“－”表示。

     2. V.P.试验

     ① 标记试管　取装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管，根据需要将培养的细菌做好标记。

     ② 接种培养　以无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管中，空白对照管不接种，置37℃恒温箱中，培养24～48h。

     ③ 观察记录　取出以上试管，振荡2min。另取5支空试管相应标记菌名，分别加入3～5ml以上对应管中的培养液，再加入40％NaOH溶液10～20滴，并加入约0.5～1mg微量肌酸，振荡试管，以使空气中的氧溶入，置37℃恒温箱中保温15～30min后，若培养液呈红色，记录为V.P.试验阳性反应（用“＋”表示）；若不呈红色，记录为V.P.试验阴性反应（用“－”表示）。

     注：原试管中留下的培养液用作甲基红试验。

     3. 甲基红试验（M.R.试验）

     取装有葡萄糖蛋白胨水培养液的试管，接种需培养鉴定的细菌，经过夜培养后，加入2～3滴甲基红指示剂，注意沿管壁加入，仔细观察培养液上层，若培养液上层变成红色，即为阳性反应；若仍呈黄色，则为阴性反应，分别用“＋”或“－”表示。

     4. 吲哚试验

     ① 试管标记   取装有蛋白胨水培养液的试管，根据需要培养的细菌做好标记。

     ② 接种培养   以无菌操作分别接种少量菌苔到以上相应试管中，第5管作空白对照不接种，置37℃恒温箱中培养24～48h。

     ③ 观察记录   在培养液中加入5～10滴吲哚试剂，使试剂浮于培养物表面，形成两层，观察结果：如有吲哚存在，乙醚层呈现玫瑰红色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应，阳性用“＋”、阴性用“－”表示