最近在做原核表达，包涵体。以前也做过，但经验不多。有那么一点失败的教训以及纯化过程中的体会，现在写出来与大家共享，同时希望得到同行们的指正。

     1. 首先介绍一下背景。载体是pET22b，Amp抗性。菌株是BL21 star DE3，是一个蛋白降解酶突变菌株，也就是说是一种优化表达菌株。

     2.第一次失败。第一次做诱导的时候，重复了很多次，但总是诱导不出来。PCR，酶切都正确。但没等测序结果出来就开始做了，失败了。曾在网上求助。后来证明是引物错误。我们实验室合成引物都要先发给一个机构，然后才由他们与公司交涉。这个office的老太太把引物弄掉了一个碱基。

     教训： 在实验过程中，再仔细都是不为过的。引物来了后管壁上贴有序列，但我忽略了。

     3. 第二次失败。后来重新构建，转化，诱导。第一次诱导时根本就没带。然后开始找闷头原因。周一下午5点我就接了DE3菌，由于那天人非常不舒服，去看医生了，等了很久，到第二天中午11点才转接！而且是按1:50转接的！也就是菌在转接之前培养了18小时！

     我们都知道，带Amp的E.coli在含Amp的平板上培养超过16 小时后，菌周围会长出小菌落，我们叫它卫星菌落。这是因为细菌在生长的时候，为了抵抗Amp，会分泌B－内酰胺酶，而该酶会降解培养基中的Amp。对Amp产生抗性的机制和其他抗生素的情况是不同的（具体可以翻看分子克隆）。到菌体生长到足够浓度的时候，培养基的Amp就会慢慢减少。 一旦细菌失去选择压力，就可能造成质粒丢失。当Amp降到很低，不足以抑制细菌生长时，未携带质粒的菌就会长得比带质粒的快。所以当培养时间足够长后，培养基中的B－内酰胺酶就会积累到很高的浓度。转接时（我是1:50转的），高浓度的酶可能破坏新鲜培养基中的Amp（而且我用的浓度是50 ug/ml）。这样，就造成最后收集的菌中，大部分都是没有带质粒的菌了。

     当然还有一个可能的原因就是死亡的菌体分泌一些降解酶，使得表达检测失败。

     这两种推测都只是推测，但我觉得第一种情况应该引起我们的重视。在使用Amp抗性的时候要格外注意。