（一）实验目的：学习细菌的鞭毛染色法

（二）实验原理：细菌的鞭毛极细，直径一般为10-20nm,只有用电子显微镜才能观察到。但是，如采用特殊的染色法，则在普通光学显微镜下也能看到它。鞭毛染色方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成。现推荐以下两种染色法。

（三）实验器材

      1. 活材料：培养12-16h的水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae），粘质赛氏杆菌（Serratia marcescens）或假单细胞菌（Pseudomonas sp.）斜面菌种。

      2. 染色液和试剂：硝酸银染色液（见附二、（一）、8）、Leifson染色液（见附二、（一-）、9）、香柏油、二甲苯。


      3. 器材：载玻片、擦镜纸、吸水纸、记号笔、玻片搁架、镊子、接种环，显微镜。


（四）实验方法


      1. 镀银法染色


      （1）清洗玻片  选择光滑无裂痕的玻片，最好选用新的。为了避免玻片相互重叠，应将玻片插在专用金属架上，然后将玻片置洗衣粉过滤液中（洗衣粉煮沸后用滤纸过滤，以除去粗颗粒），煮沸20min.取出稍冷后用自来水冲洗、晾干，再放入浓洗液中浸泡5-6天，使用前取出玻片，用自来水冲去残酸，再用蒸馏水洗。将水沥干后，放入95%乙醇中脱水。


      （2）菌液的制备及制片：菌龄较老的细菌容易失落鞭毛，所以在染色前应将待染细菌在新配制的牛肉膏蛋白胨培养基斜面上（培养基表面湿润，斜面基部含有冷凝水）连续移接3-5代，以增强细菌的运动力。最后一代菌种放恒温箱中培养12-16h.然后，用接种环挑取斜面与冷凝水交接处的菌液数环，移至盛有1-2mL无菌水的试管中，使菌液呈轻度混浊。将该试管放在37℃恒温箱中静置10min（放置时间不宜太长，否则鞭毛会脱落），让幼龄菌的鞭毛松展开。然后，吸取少量菌液滴在洁净玻片的一端，立即将玻片倾斜，使菌液缓慢地流向另一端，用吸水纸吸去多余的菌液。涂片放空气中自然干燥。


      用于鞭毛染色的菌体也可用半固体培养基培养。方法是将0.3-0.4%的琼脂肉膏培养基熔化后倒入无菌平皿中，待凝固后在平板中央点接活化了3-4代的细菌，恒温培养12-16h后，取扩散菌落的边缘制作涂片。


      （3）染色


       ①滴加A液，染4-6min.


      ②用蒸馏水充分洗净A液。


      ③用B液冲去残水，再加B液于玻片上，在酒精灯火焰上加热至冒气，约维持0.5-1min（加热时应随时补充蒸发掉的染料，不可使玻片出现干涸区）。


      ④用蒸馏水洗，自然干燥。


      （4）镜检：先低倍，再高倍，最后用油镜检查。


        结果：菌体呈深褐色，鞭毛呈浅褐色。


      2. 改良Leifson染色法


     （1）清洗玻片法同1.


     （2）配制染料  见附录二（一）9.染料配好后要过滤15-20次后染色效果才好。


      （3）菌液的制备及涂片


      ①菌液的制备同1.




      ②用记号笔在洁净的玻片上划分3-4个相等的区域。


      ③放1滴菌液于第一个小区的一端，将玻片倾斜，让菌液流向另一端，并用滤纸吸去多余的菌液。


      ④干燥  在空气中自然干燥。


      （4）染色


       ①加染色液于第一区，使染料覆盖涂片。隔数分钟后再将染料加入第二区，依此类推（相隔时间可自行决定），其目的是确定最合适的染色时间，而且节约材料。


      ②水洗：在没有倾去染料的情况下，就用蒸馏水轻轻地冲去染料，否则会增加背景的沉淀。


      ③干燥：自然干燥。


      （5）镜检  先低倍观察，再高倍观察，最后再用油镜观察，观察时要多找一些视野，不要企图在1-2个视野中就能看到细菌的鞭毛。


      结果：菌体和鞭毛均染成红色。

（五）注意事项

       1. 镀银法染色比较容易掌握，但染色液必须每次现配现用，不能存放，比较麻烦。


      2. Leifson染色法受菌种、菌龄和室温等因素的影响，且染色液须经15-20次过滤，要掌握好染色条件必须经过一些摸索。


      3. 细菌鞭毛极细，很易脱落，在整个操作过程中，必须仔细小心，以防鞭毛脱落。


      4. 染色用玻片干净无油污是鞭毛染色成功的先决条件。