脂质体介导是目前条件下最方便的转染方法之一,适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中,其转染率高,优于磷酸钙法,比它高5~100倍,能把DNA和RNA转染到各种细胞。
用LR进行转染时,首先需优化转染条件,应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等,对每批LR都要做:第一,先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间,DNA可从1~5μg和孵育时间6小时开始,按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线,再选用LR和DNA两者最佳的剂量,确定出转染时间(2~24小时)。因LR对细胞有一定的毒性,转染时间以不超过24小时为宜。
脂质体(lipofectin regeant,LR)试剂是阳离子脂质体N-[1-2,3-Dioleyoxy, Propyl]-n, n,n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1:1(w/w)]。
细胞种类:COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。
方法一、操作步骤
1. 取6孔培养板(或用35mm培养皿),向每孔中加入2mL含1~2×105 个液,37℃CO2 培养至40%~60%汇合时(汇合过分,转染后不利筛选细胞)。
2. 转染液制备:在聚苯乙稀管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)A液:用不含血清培养基稀释1-10μg DNA,终量100μL,B液:用不含血清培养基稀释2-50μgLR,终量100μL,轻轻混合A、B液,室温中置10-15分钟,稍后会出现微浊现象,但并不妨碍转染(如出现沉淀可能因LR或DNA浓度过高所致,应酌情减量)。
3. 转染准备:用2mL不含血清培养液漂洗两次,再加入1mL不含血清培养液。
4. 转染:把A/B复合物缓缓加入培养液中,摇匀,37℃温箱置6~24小时,吸除无血清转染液,换入正常培养液继续培养。
5. 其余处理如观察、筛选、检测等与其它转染法相同。
注意:转染时切勿加血清,血清对转染效率有很大影响。
方法二、快速脂质体转染法
1. 以5×105 细胞/孔接种6孔板(或35mm培养皿)培养24小时,使其达到50~60%板底面积。
2. 在试管中配制DNA/脂质体复合物方法如下:
①在1mL无血清DMEM 中稀释PSV2-neo质粒DNA或供体DNA。
②旋转1秒钟,再加入脂质体悬液,旋转。
③室温下放置5~10分钟,使DNA结合在脂质体上。
3. 弃去细胞中的旧液,用1mL无血清DMEM洗细胞一次后弃去,向每孔中直接加入1mL DNA/脂质体复合物,37℃培养3~5小时。
4. 再于每孔中加入20%FCS的DMEM,继续培养14~24小时,
5. 吸出DMEM/DNA/脂质体混合物加入新鲜10%FCS的DMEM,2mL/孔,再培养24~48小时。
6. 用细胞刮或消化法收集细胞,以备分析鉴定。
方法三、稳定的脂质体转染
1. 接种细胞同前,细胞长至50%板底面积可用于转染。
2. DNA/脂质体复合物制备转染细胞同前2、3步骤。
3. 在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM,37℃培养48小时。
4. 吸出DMEM,用G418选择培养液稀释细胞,使细胞生长一定时间,筛选转染克隆 ,方法参照细胞筛选法进行。