1.原理 DAPI 为4’,6二脒基-2-苯吲哚(4’,6―diamidino-2―phenylindole)能与双链DNA小槽,特别是AT碱基结合,也可插入少于3个连续AT碱基对的DNA序列中。当它与双链DNA结合时,荧光强度增强20倍,而与单链DNA结合则无荧光增强现象,因此是一种简易、快速和敏感地检测DNA的方法。DAPI的荧光强度虽较Hoechst低,但荧光稳定性优于Hoechst;其特异性较溴化乙啶(ethidlium bromide,EB)和碘化丙啶(propidium iodide,P1)高。
2.溶液配制
(1)0.01mol/L PBS(pH7.0):取0.1mol/L NaH2 PO4 ・H2 O 34ml、0.1mol/LNa2 HPO4 66ml、NaCl 0.9g,溶于900m1双蒸水;
(2)DAPI储存液:将0.5mgDAPI溶于5.0ml PBS中,分装,低温长期保存;
(3)DAPI工作液:用PBS稀释DAPI储存液,终浓度为0.1ug/ml。
3.染色程序
(1)培养的单层细胞 (未固定)或新鲜组织的冰冻切片等,PBS漂洗5分钟;
(2)DAPI工作液室温染色5~20分钟(可根据实验材料的染色结果而定);
(3)PBS漂洗;
(4)水溶性封片剂封片,游离细胞也可直接用含DAPI的PBS封片;
(5)荧光显微镜观察。
结果:正常的细胞核呈强荧光,细胞质无荧光;固定的组织细胞同样处理,亦可得到相似的染色结果。在有支原体污染的细胞质和细胞表面可见孤立的点状荧光,在感染痘苗病毒的细胞质中存在独特的“星状”荧光簇(star-like fluorescent clusters),腺病毒感染早期胞质中也可出现荧光。