背景知识：

    细胞转染技术是指将外源分子如DNA、RNA等导入整合细胞的技术。随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展，转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规工具。在研究极影功能、调控极影表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验中，其应用越来越广泛。影响转染效率的因素有细胞株本身的特性和活性、细胞培养条件、转染的DNA或RNA的质量、转染方法、转染试剂的选择等。常规转染技术可分为两大类，一类是瞬间转染，二是稳定转染。瞬时转染是外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中科存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其他调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24h~72h内分析果,常常用到一些报告系统如荧光蛋白、β-半乳糖苷酶等来帮助检测。稳定转染是指外源DNA既可以整合到宿主细胞染色体上，也可能作为一种游离体存在。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约万分之一转染细胞能整合，通常需要一些选择性标记，如APH、HPH、TK等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。

    本实验采用带有绿色荧光蛋白极影的质粒，利用脂质体转染人的肿瘤细胞系。绿色荧光蛋白（GFP）来源于海洋生物水木，近年来在生物化学和细胞生物学中成为最广泛应用的标记性蛋白质之一。随着对极影表达的调控，蛋白质在活细胞中自然状态下的变化等重要问题研究的深入，迫切需要一种操作方便、不用加外源底物就能在活细胞中检测的分子探针。GFP就能满足这些要求，，在分子生物学中有广泛的应用前景。GFP cDNA从水母中分离得到，是在研究水木的发光机制是发现的。钙离子和腔肠素于水母发光蛋白结合后，水母发光蛋白发蓝色荧光，同时激发GFP，使其发绿色荧光。GFP基因汗3个外显子，长2.6kb。GEP是由238个氨基酸所组成的单体蛋白，其性质十分稳定。GFP在不加任何外源物质的情况下，经紫外光或蓝光激发后即可产生绿色荧光，且荧光性质稳定。GFP基因与目的基因相连接，不影响目的基因的表达且能较好的标识出目的基因产物的位置。目前，GFP的应用已非常广泛。

    2.对GFP质粒进行除菌处理和浓度测定，可采用无水乙醇沉淀GFP质粒，再用70%的乙醇洗1或2次，将沉淀的质粒溶于灭菌的TE中，然后用紫外粉光关都系测出质粒的准确浓度，质粒的浓度（μg/ml）=OD260值×50μg/ml×稀释倍数。

    3.当细胞融合约为80%时，开始进行转染处理。在一个1.5ml的EP管中，加入100μl无血清DMEM培养基，取2ugGFP质粒DNA溶解其中；在另一个1.5mlEP管中，加入100ul无血清DMEM培养基，取6-8ul脂质体转染剂稀释于其中，再将两管溶液混合均匀，室温下放置20min。

     4.用2ml无血清DMEM培养基漂洗细胞2遍，向质粒DNA与脂质体转染剂的混合液加入0.8ml无血清DMEM培养基并混匀，然后加到漂洗过的细胞上。

     5.将细胞放入培养箱培养3-8h，然后加入1ml含20%FBS的DMEM培养基继续培养。

     6.培养24h后，将培养基吸出，加入2ml含10%FBS的DMEM培养基，37℃，5%CO2培养箱培养。

     7.在荧光显微镜下实时观察细胞，表达GFP的细胞在蓝光激发下可呈现绿色荧光。

注意事项：

    1.注意细胞的生长状态，最适合转染的细胞是达到指数生长期生长旺盛的细胞。

    2.实验前进行预试验确定适当的接种量和培养时间。

    3.DNA若不纯，会严重影响转染效率。