基因打靶细胞系的制备及应用
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发布时间：2017-09-08
近年来，基因编辑技术已经得到了迅速的发展。CRISPR- Cas9 作为第 3 代人工核酸内切酶系统，是一种具有广阔应用前景的基因定点修饰工具。利用的 CRISPR- Cas9 系统建立基因敲除的细胞系，具有时间短、难度低、费用少等优点，是广大科研工作者的好帮手。
1、基因打靶细胞系制备的基本原理
基因打靶是指通过 DNA 定点操作，改变基因组中的特定基因的编码序列，从而在细胞或生物活体内研究基因的功能及干预。细胞系基因打靶最常见的是基因敲除，其原理是：基因组靶序列经 CRISPR-Cas9 切割后在缺乏修复模板的情况下，主要以非同源重组的方式进行修复，会在切割位点插入或删除一些碱基，引入移码突变，从而导致基因不能表达有功能活性的蛋白。
2、基因打靶细胞系的应用
基因打靶细胞系在基因功能研究、人类生理病理机制研究及新药研发中起着非常重要的作用。
（1）基因功能研究
相比于基因过表达和 Knock-down 的细胞系，基因打靶的细胞系往往表型更加显着，这样对于阐明基因的功能往往更有帮助。一些基因的敲除，甚至出现细胞致死的现象。碰到这样的问题，可以采用诱导性的基因打靶方案来解决。
了解基因的功能， 对于提高人类对自身疾病、衰老、进化、种族血缘等生命现象及其本质的认识， 疾病的诊断、预防和治疗，克服生存障碍，提高生存质量，都有非常重要的意义。
（2）药物筛选
近年来，随着基因编辑技术的日益兴盛，基因编辑的疾病动物模型在药物筛选中起到越来越重要的作用。例如通过基因打靶技术构建的高度免疫缺陷的 NSG、NCG 等小鼠，用于构建 PDX 模型。同时，基因编辑的细胞模型，在肿瘤、免疫、抗体筛选等领域，也有广泛的应用前景。
（3）细胞治疗
目前最热门的细胞治疗技术，如 CAR-T,PD-1 基因敲除 T 细胞等，都用到细胞基因打靶技术。Crispr-Cas9 系统的便捷性、通用性、以及可对多个目标进行基因编辑，在细胞治疗领域有极广的应用前景和可能。
3、基因打靶细胞系的制备方法
（1）基因打靶载体的构建；
（2）细胞转染与筛选；
（3）细胞的测序鉴定；
（4）单克隆的筛选与鉴定
1. SgRNA 的设计、合成与克隆
2. 细胞转染与筛选
3. 混合样品的测序鉴定
（本文转载丁香通）
