细胞周期的测定

一、原理

二、仪器、用品与试剂

三、操作步骤

      1、细胞生长至指数期时，向培养液中加入BrdU，使最终浓度为10μg/ml。　　

      2、44小时加秋水仙素，使每ml中含0.1μg。　　

      3、48小时后常规消化细胞至离心管中，注意培养上清的漂浮细胞也要收集到离心管中。　　

      4、常规染色体制片（见第三部分：染色体技术）。　　

      5、染色体玻片置56℃水浴锅盖上，铺上2×SSC 液，距紫外灯管6cm处紫外照射30分钟。　　

      6、弃去2×SSC液，流水冲洗。　　

      7、Giemsa液染色10分钟，流水冲洗，晾干。　　

      8、镜检100个分裂相，计第一、二、三、四细胞期分裂指数。　　

      9、计算：细胞周期（Tc）=48/{（M1+2M2+3M3+4M4）/100}（小时）

附：

      （1）BrdU配制: BrdU 10mg十双蒸水10ml   4℃下避光保存。　　

      （2）2×SSC配制： NaCl 1.75克，柠檬酸三钠-2H2O0.88克，加水至100ml，4℃保存。

细胞的冻存和复苏

一、原理

      在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在-130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的-5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。

      目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。

      （本文转载：丁香通）