实验方法原理

实验材料：冻存 HeLa S3 细胞

试剂、试剂盒：70% 乙醇完全 MEM-10胰酶／EDTA

仪器、耗材：旋转瓶完全培养基-525 cm2 组织培养瓶C02 培养箱Sorvall H-6000A 转子100 ml 或 200 ml 通气旋转瓶和带滤膜的瓶盖

实验步骤

1. 将含有冻存 HeLa S3 细胞的安瓿放入 37℃ 水浴中解冻。

2. 用 70% 乙醇对安瓿的顶端进行消毒，打开安瓿，用吸管将细胞转移到含有 5 ml 完全 MEM-10 培养基的 25 cm2 组织培养瓶中，轻轻摇动培养瓶，使细胞均匀分布于培养瓶中，放入 5% CO2 加湿培养箱中 37℃ 培养过夜。

3. 将培养基吸出，用 0.5 ml 37℃ 的胰酶/EDTA 覆盖细胞，消化 30～40 s。

4. 加入 10 ml 旋转瓶完全培养基-5，并将细胞转移至 50 ml 的离心管中。室温 1800 g 离心 5 min，弃上清。

5. 将细胞沉淀悬浮在 5 ml 的旋转瓶完全培养基-5 中，上下吹打，将细胞团打散。

6. 在 100 ml 或 200 ml 通气旋转瓶中加入 50 ml 旋转瓶完全培养基-5，并将细胞悬液转移到瓶中。

7. 取出 1 ml 细胞悬液，用血细胞计数器（附录 3F) 进行细胞计数。加入适量的旋转瓶完全培养基-5，使细胞密度为（3～4）× 105 细胞/ml。将细胞放入无 CO2 培养箱，37℃ 旋转培养。

8. 随后的两天让细胞继续生长，并且每天对细胞进行计数，加入适量的旋转瓶完全培养基-5 以维持（3～4）×105 细胞/ml 的细胞密度。

9. 取 1 ml 的细胞悬液，用血细胞计数器对细胞进行监测。

10. 当细胞密度达到（4～5）×105 细胞/ml 时，隔天或每天用培养基将细胞稀释至 1.5×105 或 2.5×105 细胞/ml。

11. 分别将装有 50 ml 或 100 ml 细胞悬液的 100 ml 或 200 ml 通气旋转瓶放入 37℃ 无 CO2 培养箱旋转培养。每天或隔天传代。

注意事项： 由于有些细胞是不能被养活的，所以需要高的初始密度。

其他：HeLa S3 细胞用旋转瓶完全培养基-5 在通气旋转瓶中于 37℃ 无 CO2 培养箱生长和维持。细胞用新鲜的旋转瓶完全培养基-5 每天或隔天进行稀释，以保持细胞的密度为（1.5～5）×105 细胞/ml。

细胞活力的测定

(1)相差显微术法 在显微镜下， 根据细胞质环流和正常细胞核的存在与否，即可鉴别出细胞的死活。 利用相差显微镜可以得到更明显的图象，但在亮视野显微镜下常常也不难进行这样的观察。

(2)二乙酸荧光素 (FDA) 法： 应用这种方法可以对活细胞百分数进行快速的目测 , 首先用丙酮制备 0.5%的 FDA 贮备液 , 置 0℃下保存。当要测定细胞活力时， 将贮备液加到细胞悬浮液中， 加入的数量以使最终浓度为 0.01%为准。混匀，在室温下作用 5 分钟，然后在带有适当的激发滤片和吸收滤片的荧光显微镜进行观察。FDA本身无荧光、无极性，可自由透过细胞质膜进入内部，进入后由于受到活细胞内脂酶的分解，而产生有荧光的极性物质荧光素， 它不能自由出入质膜。 在荧光显微镜下可观察到产生荧光的细胞， 表明是有活力的细胞； 相反，不产生荧光的细胞，表明是无活力的死细胞。 细胞活力以发绿色荧光的活细胞数占总观察细胞数的百分数表示。

(3)伊文思兰染色法：这种方法可用做FDA的互补法。当伊文思兰的稀薄溶液 (0.025%)对细胞进行短时间的处理， 只有活力已受损伤的细胞能够摄取这种染料， 而完整的活细胞不能摄取这种染料。 因此，凡不染色的细胞皆为活细胞。 但是染色时间不能太长， 否则活细胞也会逐渐积累染料而染成颜色。 细胞活力以未染色的活细胞数占总观察细胞数的百分数表示。

实验问答

问：悬浮细胞一般几天离心一次，觉得好难养啊！求心得？

答：你养的是什么细胞，原代吗？我觉得悬浮细胞最好养了，不用消化，关于几天离一次心，要看你的细胞生长状态了，我养过血液肿瘤细胞，增值比较快，我一般是第二天半量换液（加等量培养基后一分二），第三天若长得比较满，就离心换液。若你不想每天都去管它，你可以把细胞密度中的相对稀一点（不能太稀，太细了细胞不好好长），可以2-3天换一次液（半量，不用离心），这要看细胞状态，和你试验进度，若你急着用细胞，那就将细胞中密一点，天天换液，用胎牛血清，这样细胞会疯长的。要是比较娇气的细胞，象RPMI-8226，一定要用胎牛血清，2-3天半量换液，依据细胞状态再离心换液，等细胞进入对数生长期了，养起来也就好养了。若是正常人T细胞，也要3-5天换一次液，最好3天的时候加入些新培养基，我曾经有一次1周忘了换液（因为T细胞增殖很慢，或者说在体外不给刺激基本不增殖，所以培养基的颜色不发生改变，但它也消耗营养），最后作流式发现细胞大部分凋亡和死亡了。