错误1：一小管原代细胞在水浴中解冻一段时间

纠正1：原代细胞对解冻过程非常敏感，因此将小瓶置于37℃水浴中，保持并轻轻旋转直到内容物刚刚解冻是很重要的。然后应立即从水浴中取出小瓶，并转移到无菌操作台。确保您的培养瓶在解冻前已经准备就绪，以便可以立即用于接种细胞，并置于培养箱中。

错误2：解冻match小瓶后直接离心原代细胞

纠正2：我们不建议在解冻后离心细胞，因为离心程序比少量的DMSO残留更有害。记住，在恢复原代细胞后的第二天更换培养基以去除任何残留的DMSO。

错误3：允许原代细胞变得过于融合

纠正3：当生长至100％汇合时，原代细胞可以变得衰老。记住，原代细胞不是100％纯，因此重要的是尽量减少污染细胞的生长。我们建议在细胞达到90-95％融合时，对原代细胞进行传代培养。

错误4：传代原代细胞时过度胰蛋白酶消化

纠正4：当细胞传代时，使用低浓度的胰蛋白酶并在显微镜下密切监测细胞。此外，记得在胰蛋白酶消化后完全中和细胞中的胰酶，因为任何活性的胰蛋白酶都将损伤细胞。

错误5：原代细胞可以很容易地重新冻存

纠正5：通常我们不推荐重新冻存原代细胞，因为这可以促进细胞衰老和/或导致功能变化。原代细胞非常敏感，重新冻结可能导致细胞死亡或损伤。

错误6：原代细胞可以无限的增殖

纠正6：与细胞系不同，原代细胞具有有限的扩增能力。我们建议尽早使用原代细胞进行实验以防止遗传漂移。此外，如果你正在使用一个增值困难的细胞类型，你应该密切监测细胞形态，因为少量混杂的细胞（如成纤维细胞）可能随着时间的推移，大量生长从而成为主要细胞。

错误纠正后就该步入正轨啦——

应如何进行冻存细胞的培养？

下列步骤以单管冻存细胞进行培养的实验方案为例。

● 准备一烧杯37°C的水。

● 从液氮储存中取出一管细胞，注意保护手和眼睛。

● 拧松管盖1/4圈，等待10秒钟以释放螺纹中可能残留的液氮，再重新拧紧管盖。

● 将冻存管的下半部分置于37°C水浴中进行解冻，直至冻存管内仅剩余一小块冰芯，使细胞迅速解冻。

● 用消毒液擦拭管体外表面，再将其移至II级A型层流细胞培养通风橱中。

● 打开管盖，使用1 mL移液器上下吹打细胞悬液以分散细胞。

台盼蓝染色（中洪博元实拍图）

● 从管中吸取20 uL细胞悬液，并将其稀释于20 uL台盼蓝溶液中（如：Gibco™台盼蓝，货号 15250-061）。

● 使用血细胞计数板来确定每毫升悬液中的活细胞数。

● 将管中悬液（1 mL）稀释至产品说明中的推荐浓度（例如1.25 x 10E4活细胞/毫升，Gibco™ 新生人表皮角质形成细胞）。

● 将5 mL细胞悬液加入25 cm2培养瓶，或将15 mL细胞悬浮液加入75cm2培养瓶中。

● 摇匀培养瓶中的培养基以彻底分散细胞。许多类型的细胞都会迅速贴壁，如果没有在传代后即刻摇匀细胞，细胞可能生长不均匀。

● 在37°C、5% CO2/95%空气、湿度细胞培养箱中培养细胞。为了获得最佳结果，培养开始后至少在24小时之内不要扰动细胞。

是否可以对扩增后的细胞重新冻存？如果可以该如何操作？

当从Thermo Fisher Scientific购买了Gibco™或Invitrogen™冻存或正处于增殖期的细胞，可对其进行扩增和重新冻存。不过，冻存操作可能会对细胞的生长状态有所影响。下列实验方案为大家提供了一份使用Synth-a-Freeze™培养基冻存细胞的基础指南，Synth-a-Freeze™培养基是Thermo Fisher Scientific旗下的一款成分确定，无蛋白成份的冻存培养基。

请注意：由于冻存设备与个人技术之间的差异，我们无法确保使用本方案冻存的细胞在复苏后能够保持活力，我们也无法为研究用户实验室冻存细胞的效果进行担保。

● 使用37°C水浴化冻Synth-a-Freeze™培养基或4°C条件下过夜化冻。

● 如果在水浴中进行化冻，请确保温度不要超过37°C，也勿将该产品延长时间置于37°C。

● Synth-a-Freeze™培养基在使用前应置于4°C条件下彻底平衡。为获得最优结果，推荐大家使用能够控制变温速率的冰箱。如果缺少能够控制变温速率的冰箱，也可使用细胞冻存盒（如Thermo Scientific™ Mr Frosty™ container)。

● 如需用酶试剂解离培养器皿表面的细胞，则需使用对应的终止溶液重悬细胞以中和酶的效果。

● 通过离心沉淀细胞。

● 去除上清液后，使用预冷的Synth-a-Freeze™培养基以5x10E5至3x10E6细胞/毫升的密度重悬细胞。

● 将细胞悬液分装至合适数量的冻存管中。

● 将细胞尽快冷却至4°C。

● 如果使用控制变温速率的冰箱：以每分钟降低1°C的速率冰冻样品，直至–40°C。之后按照每分钟降低2°C的速率降至–90°C左右。

● 如果使用细胞冻存盒：请按照说明书来准备冻存盒。

● 为获得最佳结果，推荐大家在细胞温度降至–80°C后，尽快将冻存管转移至液氮储存设备的气相中。

● 作为Synth-a-Freeze™培养基的替代品，可使用该冻存细胞推荐的基础培养基，添加10%胎牛血清（FBS）和10% DMSO进行细胞冻存。请注意不推荐将Synth-a-Freeze™培养基用于人表皮黑素细胞的冻存操作。

中洪实验室温馨提醒：

组织块贴壁法分离细胞时：注意组织块贴壁2-3h后，补液时沿壁轻轻加入培养基，防止组织块漂浮。