四唑盐（MTT）比色法可以：（1）检测细胞存活和生长；（2）大规模的抗肿瘤药物筛选；（3）细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定；（4）生物活性因子的活性检测。

 
实验方法原理： MTT法是Mosmann 1983年报道的，以后此方法得到了迅速发展并广泛应用于临床与科研研究。其原理是活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值。

实验材料： 细胞样品
试剂、试剂盒：PBSDMSO胰蛋白酶甘氨酸缓冲液二甲亚枫
仪器、耗材： 加样器96孔培养板酶标仪培养板

实验步骤

 一、实验前应明确的问题
 
1.  选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。
 
2.  药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。
 
3.  时间点的设定。在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。
 
4.  培养时间。200 ul的培养液对于10的4~5次方的增殖期细胞来说，很难维持68 h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48 h换液的。
 
5.  MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。
 
6.  理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。
 
7.  实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。
 
8.  避免血清干扰。用含15%胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。

二、贴壁细胞
 
1.  收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100 ul，铺板使待测细胞调密度至1 000-10 000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。
 
2.  5% CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物，原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药。一般5-7个梯度，每孔100 ul，设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况。
 
3.  5% CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
 
4.  每孔加入20 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5% MTT），继续培养4 h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。
 
5.  终止培养，小心吸去孔内培养液。
 
6.  每孔加入150 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
 
7.  同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）
 
三、悬浮细胞
 
1.  收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将

（1）补足的1640（无血清）培养基40 ul ；

（2）加Actinomycin D（有毒性）10 ul用培养液稀释 （储存液100 ug/ml，需预试寻找最佳稀释度，1：10-1：20）；

（3）需检测物10 ul；

（4）细胞悬液50 ul（即5×104cell/孔），共100 ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100 ul 1640）。
 
2.  置37℃，5% CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
 
3.  每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5% MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）
 
4.  离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。
 
5.  同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。
 
四、MTT的配制
 
MTT一般最好现用现配，过滤后4oC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多，尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。
 
MTT有致癌性，用的时候小心，有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.
 
配制MTT时用用PBS溶解，也有人用生理盐水配，60℃水浴助溶。
 
1.  PBS配方
 
（1）NaCl ：8 g。
 
（2）KCl 0.2：g。
 
（3）Na2HPO4 ：1.44 g。
 
（4）KH2PO4：0.24 g。
 
（5）调pH7.4。
 
（6）定容1 L。
 
五、细胞的接种（铺板）
 
细胞过了30代以后就不要用了，因为状态不好了；培养板要用好的（最好进口板），不好的板或重复利用的板只可做预实验。
 
接种时最好按照预实验摸索出的密度接种， 因为细胞密度在10000/ml左右时，所测得的OD值的区间即细胞抑制率（或者增值率）的所呈现的线性关系最好，结果最可信。如果铺的太稀细胞的杀伤不会很明显，太密细胞可能都会凋亡，因为细胞长的太快营养会不够，最后导致死亡。且而细胞过密或者过少，增殖都会过快或者过慢，其增值率线性关系不佳。故而MTT细胞密度多采用10000/ml，100 ul/孔。
 
细胞密度要根据不同细胞的特点来定.如果你做的药品对细胞具有刺激作用那么取小点的细胞浓度，如果你做的药品对细胞具有抑制作用那么取大点的细胞浓度，这样与对照的区别更明显，数据更好。悬浮细胞每孔的细胞数可达到105，贴壁细胞可为103-104。
  
注意事项：
1.  选择适当得细胞接种浓度。
 
2.  避免血清干扰：一般选小于10％的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。
 
3.  设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。
 
MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系，IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50％抑制率时候的药品浓度，就是IC50。要点：药品2倍稀释，多做梯度，做点线图即可！
 
举个例子：
 
各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，最大浓度为0.1，抑制率为0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21、0.06。代入计算公式：
 
Pm=0.95
 
Pn=0.06
 
P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1
 
Xm=lg0.1=-1
 
lgI=lg0.1/0.01=1
 
lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025
 
IC50=0.00025
 
参考公式：
 
lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)
 
Xm:lg 最大剂量
 
I:lg(最大剂量/相临剂量)
 
P:阳性反应率之和
 
Pm: 最大阳性反应率
 
Pn: 最小阳性反应率
 
抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值
 
公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率
 
例：
 
用96孔板培养SMMC-7721肝癌做MTT测细胞活力，应该加多少1640培养基，多少MTT和DMSO合适根据书上说的加200 ul 1640，20 u lMTT，150 ul DMSO加DMSO之前要尽量去掉培养液，便于DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定，一般每孔4000个细胞为宜，既细胞浓度在20000个/ml，MTT加20 ul，作用四小时后洗掉上清液，注意不要将甲瓉洗掉，然后每孔加150 ul DMSO，在脱色摇床上振荡10分钟，然后测吸光值。
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一、经验总结

1.  首先细胞的接种密度一定不能过大，一般每孔1000个左右就够了，我认为宁少勿多。尤其是对于肿瘤细胞。10000/孔是太高了，这样即使药物有作用，MTT方法也是表现不出的，最佳点板浓度在4000-5000/孔，太少的话SD值会很大。
 
2.  MTT本身就是比较粗的实验，增殖率10%左右的波动都不算奇怪。特别是新手，20%的波动也是常见的，所以很可能是技术原因引起的，特别是种板技术一定要过关。
 
3.  我做的是肿瘤细胞的MTT实验，这种细胞长的很快一开始我是用100000/ML的浓度来接种的，结果细胞长的太满结果是没有梯度也没有线性关系.后来调整浓度，用过40000~80000/ML的浓度都做过MTT实验，结果发现做的结果比较好点的是60000~70000/ML的浓度组的.用40000/M的浓度的组，由于细胞少，药物作用的梯度还是有，只是没有很好的线性关系.还有根据细胞生长速度以及药物的特性（有时间依赖性和浓度依赖性的药物）来确定培养时间是48小时还是72小时.
 
4.  注意细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。加样器操作要熟练，尽量避免人为误差。虽然移液器比移液管精确得多，但是如果操作不熟，CV会在8%左右。另外，吹散次数过多也会影响细胞活力。所以要熟练鞋、快些上板。

二、实验心得分享

1.  吹打时悬液总量不能太多，达到吸管吸液量的3-4倍，可能比较容易混匀。10 ml的离心管里面最好装3-4 ml的悬液：悬液太少容易吹起很多气泡，悬液太多又不容易吹成单细胞悬液。
 
2.  吸管的吸液量最好在1 ml左右：吸液量过多的话，一下吸起很多液体，管中所剩就很少，这样吹打容易起泡，吸液量过少，吹打的力度就不够，吹打就会不均匀。如果是吸液量1 ml多的吸管，总液量在5 ml左右为益。
 
3.  吸的时候要在悬液底部，然后提起来一点，但是吹下去的时候不要离开液面，否则容易吹打出气泡。
 
4.  吹打次数100左右，就可以吹打均匀了（有人认为加细胞前吹打30-50次基本就差不多均匀了。加细胞的时候每接种2孔反复吹打3次，每吹打3次后枪头垂悬与细胞悬液中5秒钟，然后再以一定的速度吸取悬液。）
 
5.  向每孔中用枪头加入细胞时不要太快，否则你会发现细胞在加入的瞬间会由于枪头的冲力在孔底聚集一堆，一般都在孔的底部中央，而周边很少，这种不均匀的分散会产生接触抑制，影响细胞的生长。所以速度不能太快也不能太慢。我习惯每块板加完后平握手中，向左3下，向右3下，在往返回复3下移动，目的是使得细胞能分散的均匀些。（铺板技术是MTT实验的关键，也是基础，一定要练好。曾经有同学用漩涡振荡器混匀细胞，最后细胞全死了，建议不要采用这种方法混匀细胞。