巨噬细胞的分离与纯化实验方法
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发布时间：2016-11-24
一)从小鼠、豚鼠或家兔腹腔中分离巨噬细胞
1.取6周左右的小鼠(或600克左右的豚鼠，或3公斤左右的家兔)，剃去腹部的毛并消毒。腹腔注射1ml(豚鼠20ml，家兔200ml)无菌的液体石蜡或巯基乙酸肉汤或4%淀粉肉汤。3～4天以后收集腹腔细胞。
2.如要收集腹腔静置巨噬细胞，不注射刺激物，直接从这一步开始。放血处死动物，以减少腹腔中的红细胞。消毒腹部，沿腹中线注入3～4ml(豚鼠20～40ml，家兔50～70ml)冰中预冷的无菌PBS -H(含10U/ml肝素和10%小牛血清的PBS)。轻轻按摩腹部5分钟。
3.以下均无菌操作。剪开腹壁，用吸管吸出渗出液，再用同样容量的预冷PBS -H冲洗腹腔2～3次。合并渗出液于离心管中，4℃离心250×g 10分钟，去上清液。
4.用预冷的RPMI-1640 培养液洗涤细胞3次，每次4℃离心250×g 10分钟，去上清液。用预冷的适量RPMI-1640培养液悬浮细胞，台盼蓝染色计数细胞并决定细胞活力。
二)家兔肺泡巨噬细胞的分离和纯化
1.取2～3公斤重的家兔，耳缘静脉注射10ml空气处死动物或注射2ml(含130mg)戊巴比妥麻醉动物。仰卧固定，消毒胸部，剪开胸壁。以下过程注意无菌操作。小心从环状软骨下方剪下气管，分离心脏和血管，取出肺，剪去脂肪和结缔组织。用无菌纱布小心擦净肺表面，称重。
2.分离肺泡巨噬细胞：用夹子夹住气管，使肺悬空。向气管中注射40ml无菌的冷生理盐水，让生理盐水进入全部肺泡。用镊子提起气管，从夹子下面剪断气管，将肺中的液体倒入离心管中。再用同样方法，用40ml无菌冷生理盐水冲洗肺泡，合并浸出液，置4℃。
3.分离肺组织中的巨噬细胞：取出肺泡巨噬细胞后，剪去气管，将肺组织放在有冷RPMI-1640 培养液的平皿中。平皿置冰上，用吸满冷RPMI-1640培养液的20ml注射器接23号针头，一边灌注一边用针头梳离肺组织，直到肺组织与支气管树全部分离。使肺组织通过200目的钢丝网，分离单个细胞。
4.以下过程均在4℃中进行。分别处理肺泡巨噬细胞和肺组织中的巨噬细胞：离心200×g 10分钟，去上清液。轻弹试管，悬浮细胞，加入10ml低渗液(20mmol/L Tris, 0.75%氯化铵，pH7.4)，37℃处理3～5分钟，溶解红细胞。红细胞通常分别占肺泡巨噬细胞和组织巨噬细胞的1%和10%。也可以不用低渗处理，直接在淋巴细胞分离液上分离巨噬细胞。
5.离心200×g 10分钟，去上清液。用RPMI-1640 培养液洗涤细胞一次。将细胞悬液加在淋巴细胞分离液(比重1.077)上，离心400×g 20分钟，收集交界面的巨噬细胞。弃去沉淀的死细胞和红细胞。
6.用RPMI-1640培养液洗涤巨噬细胞2次。台盼蓝染色检测细胞活力和细胞数，将细胞配成所需浓度。此时巨噬细胞活力可达90%以上，巨噬细胞占全部细胞的90%以上。
