目的  筛选并验证 RAW264. 7 细胞中电穿孔转染 TRIB3 过表达质粒和 TRIB3 siRNA 的条件,建立适用于 RAW264. 7 细胞的最佳电穿孔转染方案。

　　方法  通过改变脉冲电压、脉冲时长和质粒浓度等条件,将载体 为 pCMV6-Entry 的 TRIB3 过表达质粒和 TRIB3 siRNA 转入 RAW264. 7 细胞,24 h 后相差显微镜观察细胞形态, CCK-8法检测细胞存活率,72 h 后 Western Blot 法检测 TRIB3 蛋白表达以验证目的基因表达改变情况。

　　结果  (1) 以不同脉冲电压转染时,110 和 120 mV 组细胞形态和存活率与对照组无差异,130 和 140 mV 组悬浮细胞较多、细胞存活率显著低于对照组(P< 0. 01),120、130 和 140 mV 组 TRIB3 蛋白表达显著增加(P< 0. 05);(2)以不同脉冲 时长进行转染时,10 和 20 ms 组细胞形态和存活率与对照组无差异,30 ms 组细胞存活率显著低于对照组(P< 0. 01),20 和 30 ms 组 TRIB3 蛋白表达显著增加(P< 0. 01);(3)以不同质粒浓度进行转染时,2 和 4 μg 组细胞形态 和存活率与对照组无差异,6 μg 组细胞存活率低于对照组(P< 0. 05),4 μg 组 TRIB3 表达显著增加(P< 0. 01);(4) 以 120 mV、20 ms 条件转染不同浓度 TRIB3 siRNA 时,各组细胞形态和存活率均与对照组无差异,10 nmol / L 组 TRIB3 表达仅为对照组的 0. 19 倍( P< 0. 01)。

　　结论 以 120 mV、20 ms 条件在 RAW264. 7 细胞中电穿孔转染 TRIB3 过表达质粒(每样本 4 μg)和 TRIB3 siRNA(10 nmol / L),在保证较高的细胞存活率的同时能显著改变目的基 因的蛋白表达水平,为后续 RAW264. 7 细胞中质粒转染相关的基础研究提供实验依据和借鉴。