背景：硬脑膜动静脉瘘（DAVF）是一种异常的连接动脉和脑膜静脉或硬膜静脉窦或皮质静脉。是一种颅内血管畸形。硬脑膜动静脉瘘约占颅内血管畸形的10-15%，幕上动静脉畸形6%和幕下动静脉畸形的35%。硬脑膜动静脉瘘可发生在任何部位，但这些血管畸形最常见于海绵窦、横窦、乙状窦及上矢状窦（SSS）。DAVF的治疗形式主要是血管内栓塞治疗。DAVF的原因尚未明确。有先天和后天的原因。有一种观点认为，硬脑膜动静脉瘘是一种颅内动静脉畸形和硬脑膜血管异常引起的先天性疾病。已经有很多临床试验表明，硬脑膜动静脉瘘的形成可能是造成脑外伤，静脉窦炎症、静脉窦血栓形成、颅内肿瘤、脑手术、高凝状态、血液分子异常等，DAVF是一种获得性血管疾病。认为获得性DAVF是由于DAVF和静脉窦血栓形成之间的关系较为密切。许多研究者建立了大鼠静脉窦高压模型颈总动脉颈外静脉吻合（CCA-EJV）方法。1）高静脉窦压力可能诱发DAVF；2）自动排除大静脉窦压力后DAVF消失；3）术后28 d，高压组静脉压明显升高；4）静脉窦血栓形成是高静脉窦压的危险因素。有利于DAVF形成关键点是颅内静脉窦压增高。有两种理论解释：一是开放的"生理动静脉吻合"，另一种是"血管内皮生长因子诱导的硬脑膜血管生成。"本研究的目的是通过使用兔模型诱导形成的高颅内静脉压调查更详细的DAVF形成机制。本研究采用cca-pfv吻合产生高颅内静脉压模型，成功诱导DAVF形成，首次发现缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和血管内皮生长因子在兔模型中的表达。

　　方法：实验动物：该研究经过福利伦理委员会的批准。100只日本大耳雄兔（体重2.0~2.5 kg）。

　　麻醉：通过注入1%戊巴比妥钠（25毫克/公斤）到耳静脉（EV）进行麻醉诱导，包括动静脉吻合，颈动脉放置导管，收获标本。百分之一戊巴比妥钠经导管注入颈动脉进行脑血管造影。

　　动物准备：实验动物分组：五十只雄性日本长耳兔随机分为五组，A -E. A组（对照组）假手术（n = 10）。B组实行右侧颈总动脉（CCA）-面后静脉（PFV）端端吻合术(EEA) （n = 10）。C组实行右侧颈总动脉（CCA）-面后静脉（PFV）加左侧颈外静脉（EJV）（n = 10）。D组实行右侧颈总动脉-面后静脉cca-pfv端侧吻合（ESA）（n = 10）。E组实行右侧右侧颈总动脉-面后静脉cca-pfv端侧吻合加左侧颈外静脉（EJV）结扎（n = 10）。术后7、14、90天各组随机抽取2只兔，墨汁灌注后计数硬脑膜微血管数。术后90天，每组选取4只兔进行数字减影心血管造影术冰观察DAVF的形成。

　　另取五十只日本大耳白兔随机分为五组，A -E组。A组（对照组）假手术（n = 10）。B-E组（n = 40）实行右侧颈总动脉（CCA）-面后静脉（PFV）端端吻合术(EEA)加左侧颈外静脉（EJV）结扎。

　　在B、C、D、E组（n=10）分别于术后1周、2周、三周、术后第90天取标本进行进一步免疫组化（每组6只）和蛋白印迹分析（每组4只）。

　　模型制备：手术前动物禁食10小时，不限制饮水。1%戊巴比妥钠（25毫克/千克）被注入到左耳静脉EV。麻醉后将兔固定在手术台上。颈部去毛并用碘伏消毒，皮肤切口在颈部。以下步骤在显微镜下进行。

　　1、 A组：解剖分离出双侧颈外静脉。近端是在前、后面部静脉和颈外静脉交叉前部1cm结扎，远端是前、后面部静脉和颈外静脉交叉后部1cm结扎。暴露右侧颈动脉三角，钝性分离2厘米的CCA。24 #静脉（IV）导管分别穿刺入面后静脉（PFV）和CCA，并与侵入式压力测量仪器相连，测量CCA和PFV实验压力。局部应用少量青霉素后缝合切口。

　　2、 B组分离出双侧颈外静脉和右侧CCA（长度等于假手术组）。测定正常的动脉压和PFV压力。右侧颈外静脉的前端被结扎（前面部静脉和后前面部静脉和颈外静脉的交界处0.5厘米）。前面静脉远端（AFV）也被结扎。用血管夹夹住PFV，面后静脉（PFV）与颈外静脉交叉处前约3cm处切断。CCA的近端被截断，远端被结扎和切断，血管的内腔用1毫克/毫升肝素/生理盐水溶液洗涤。CCA和PFA的残余部分用亚甲蓝染色，然后用1毫克/毫升肝素/生理盐水洗涤。端到端的CCA和PFV吻合用9-0缝线进行。吻合术后进行吻合口通畅验证。测量吻合后的PFV压力，和切口使用少量青霉素后缝合伤口。

　　3、 C组  分离出右侧CCA、EJV和左侧EJV。左侧EJV用4-0缝合结扎。其他操作同B组。

　　4、 D组 分离出双侧颈外静脉与右侧CCA（分离长度与假手术组相同）。测定正常的动脉压和PFV压力。对右侧EJV的前段和AFV的远端进行结扎。夹住PFV，在PFV和EJV交叉处约3mm的地方切断。血管腔用1毫克/毫升肝素/生理盐水洗涤。使用两个血管夹来夹住CCA，两个剪辑之间的距离是约1.5厘米。用微剪刀沿容器壁切入，切口长度为管径的1.5倍长。血管的内腔用1毫克/毫升肝素/生理盐水溶液洗涤。CCA的切口和PFV残段用亚甲基蓝染色并用1毫克/毫升/肝素生理盐水溶液冲洗。颈总动脉与PFV之间用9-0缝线进行端侧吻合。对吻合口通畅进行验证。测量吻合后的PFV压力，切口使用少量青霉素后缝合。

　　5、 E组：分离出右侧CCA、EJV和左侧EJV。左侧EJV用4-0缝线结扎。其他操作同D组。

　　测量压力：将5组共50只兔的右侧颈总动脉（CCA）剥离出来，并测量CCA压力。

　　颈总动脉血压测量：剥离CCA约2cm，24#IV导管从尾部插入，用血管夹固定，并连接无创血压测量装置。在心脏水平，压力调整到零。在读数稳定后，进行拍摄和记录。

　　面后静脉压力测量：将5组共50只兔的面后静脉（PFV）剥离出来，并测量PFV压力。剥离右侧颈外静脉、面前静脉和面后静脉的总长度约2cm。将24#IV导管通过静脉瓣膜插入PFV，固定后与侵入式压力测量仪相连。在心脏水平，压力调整到零。在读数稳定后，进行拍摄和记录。

　　吻合术后面部静脉压力的测量：B-E组的40只兔子，在测量PFV压力和剖杀之前验证cca-pfv吻合术后吻合口通畅。将24#IV导管通过静脉瓣膜插入PFV，固定后与侵入式压力测量仪相连。在心脏水平，压力调整到零。在读数稳定后，进行拍摄和记录。

　　墨汁灌注：从B-E组做完CCA-PFV吻合术后的第7、14、90天和A组每组选取2只兔进行投颈部墨汁灌注。计数硬脑膜微血管密度。

　　DSA检查：术后90天，从五组中每组选取4只兔头颈部进行DSA检查。具体程序如下：

　　导管放置在颈动脉：经过耳静脉注射1%戊巴比妥钠（25mg/kg）麻醉动物，将家兔置于仰卧位并固定在手术台。沿原颈切口进行解剖。右动静脉吻合部位仔细解剖。周围有许多新的静脉形成。经验证吻合口通畅后，测量术后面部静脉压。固定吻合部位。剥离左CCA，并放置24G静脉导管。导管充满1毫克/毫升肝素，闭合颈部切口。

　　获取DSA图像：通过CCA注射1%戊巴比妥钠，将家兔置于仰卧位并固定于DSA桌。调整机器的位置，iohexol-300是通过放置在CCA造影导管注射（2ml/s，3ml）。拍摄前后X线片。

　　免疫组化：从对照组、7天、14天、21天和90天组，每组6只兔采集枕叶皮质和硬脑膜标本进行HIF-1α和VEGF免疫组化。枕叶皮层的选择，因为该区首先受吻合影响产生颅内高压且其能较方便地进行试验。将免疫组化切片组织，福尔马林固定后石蜡包埋，切片用苏木精和曙红（HE）染色。组织切片与下列主要抗体孵育：血管内皮生长因子（VEGF）（C）（1∶100），缺氧诱导因子- 1α（1∶200）4°C孵育过夜。然后用辣根过氧化物酶标记小鼠抗兔二抗体孵育（1:1000）。免疫组织化学分析用的3,3'- Diaminobenzidine（DAB）方法进行。所有标本在倒置显微镜和Olympus BX51照相系统下观察。百分比为阳性细胞数目除以总细胞数。用于表达水平分配数值的标准如下：-=0% ，+ = > 0% - 25%，+ +=26% - 50%，+ + +=51% - 75%，+ + + + = > 75%。

　　Western印迹法：从对照组、7天、14天、21天和90天组，每组4只兔采集枕叶皮质和硬脑膜标本进行免疫印迹。用RIPA缓冲液裂解标本，由Bradford法测定蛋白质提取物的浓度。40μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳，转移到10%  PVDF膜，在含0.1%吐温20和5%脱脂奶粉的TBS溶液中孵育。然后膜用特异性血管内皮生长因子VEGF（C-1）一抗（1:200），HIF-1α一抗（1:200），和α微管蛋白（分子量为52 kDa，1:3000）在4°C孵育过夜。膜用辣根过氧化物酶标记的鼠抗兔抗体孵育（1:1000）。使用增强的化学发光辣根过氧化物酶底物观察免疫反应带。结果代表三个独立的实验。定量分析是由GE图像扫描仪Quantity One软件进行。

　　结果：B组和C组动物术后均存活。由于颅内静脉压过高，D组和E组各2只兔术后3 d内死亡。吻合口通畅率B组的为80%，C组为90%，D组为60%，E组为50%。

　　围手术期血压：术后B-E组吻合口通畅的频率无显著差异。假手术组（A组）术后静脉血压与基线比较差异无统计学意义。B-E组动物手术后和处死前，静脉压力同基线相比显著增加。术后及处死前与对照组比较，术后静脉血压明显升高。B组和C组动物的静脉血压明显高于D组和E组。B组与C组、D组与E组间差异无统计学意义。

　　脑墨汁灌注：对硬脑膜血管微血管由凸矢状窦宽2毫米和3毫米以上的横窦进行观察和比较。硬脑膜毛细血管计数为微血管/每平方毫米数。对照组硬脑膜微血管计数为12±2平方毫米，术后14天计数为15±2平方毫米，略有增加。90天后，脑膜微血管计数明显增加， B，C，D，和E组分别为36±4平方毫米，39±5平方毫米，33±3平方毫米，35±4平方毫米。

　　DSA检查：手术后90天A-E组每组抽取4只进行 DSA检查。动脉期DSA图像如图4所示，静脉期如图5所示。在A组，血管通畅，无异常的血管，血液循环的时间约为11-15 S。在B，C，D和E组，耳朵和眼睛区域观察到血管迂曲、硬脑膜动静脉瘘和AVF。在一些动物中，观察到两个或两个以上的动静脉瘘。在16只兔中观察到22例动静脉瘘。其中，7例为DAVFs，因此DAVF形成率为43.75%（7 / 16）。DAVFs主要位于SSS、海绵窦、横窦。DAVFs通过SSS、横窦、面后静脉被排出；眼睛动静脉瘘经前面部静脉引流；耳动静脉瘘镜面后静脉引流，颈动静脉瘘通过面后静脉引流。在B，C，D和E组循环时间延长（大约32-40S）。静脉期的循环时间明显延长，而在动脉期则没有明显延长（约5 s）。

　　免疫组化法检测VEGF和HIF-1α的表达水平：1周和2周组的枕叶皮层和血管内皮细胞VEGF表达显著高于对照组、3周和90天组。与对照组相比，2周组动物SSS中VEGF表达水平明显升高。与对照组和2周、3周、90天组比较，1周组在枕叶皮质、软脑膜血管及SSS中均有较高的HIF-1α表达。

　　Western blot分析VEGF和HIF-1α的表达水平：枕叶硬脑膜VEGF表达水平和枕叶皮质及SSS区HIF-1α表达水平相似。表达峰值出现在1周，其次是2周、3周、第90天和对照组。枕叶硬脑膜VEGF表达在对照组，1周，2周，3周，和90天的平均表达水平分别为10.1，27.2，34.1，16.9和11.8。枕叶皮质HIF-1α在对照组，1周，2周，3周，和90天的平均表达水平分别为9.1，35.6，24.7，20.5，10.1。SSS区HIF-1α在对照组，1周，2周，3周，和90天的平均表达水平分别为9.4, 35.6, 26.7, 17.7, 10.6。两组间比较均有统计学意义。

　　结论：动物模型实验结果表明，颅内高压是DAVF形成的关键因素。脑缺血引起的脑灌注压缺乏在这个过程中起着关键作用，颅内静脉压增高导致HIF-1α表达增加，VEGF表达增加。