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RT-PCR的注意事项

一、防止RNA酶污染的措施
       1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
       2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意:有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀,故不能使用)。
       3. 有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再浸泡在3% H2O2 室温10min,然后用0.1% DEPC水冲洗,晾干。
       4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC,在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂,应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制,然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
       5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套,实验过程中手套要勤换。
       6. 设置RNA操作专用实验室,所有器械等应为专用。


二、常用的RNA酶抑制剂
       1. 焦磷酸二乙酯(DEPC):是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性,从而抑制酶的活性。
       2. 异硫氰酸胍:目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂,它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,又对RNA酶有强烈的变性作用。
       3. 氧钒核糖核苷复合物:由氧化钒离子和核苷形成的复合物,它和RNA酶结合形成过渡态类物质,几乎能完全抑制RNA酶的活性。
       4. RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin):从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂,可以和多种RNA酶结合,使其失活。
       5. 其它:SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。


       因为DEPc不加选择的修饰蛋白质和RNA,因此在分离和纯化RNA过程中不能使用,而且它与一些缓冲液(例如Tri)不能相容。

       在所有RNA实验中,最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。
       RNA酶可耐受多种处理而不被灭活,如煮沸、高压灭菌等。
       研究人员造成的污染 RNA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此进行RNA实验时应勤换手套。

       但DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。


       (本文转载丁香通

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