(1)酶失活或在反应体系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或运输不当而失活,往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。
(2)模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸,造成DNA脱嘌呤而影响PCR的结果。
(3)变性温度是否准确:PCR仪指示温度与实际温度是否相符,过高酶在前几个循环就迅速失活;过低则模板变性不彻底。
(4)反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶,应在未加Taq酶以前,将反应体系95℃加热5-10分钟。
(5)引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化,或因储存条件不当而失活。
(6)引物错误。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
(7)DNA凝胶电泳时加入阳性对照,确保不是DNA凝胶和PCR程序的问题。
(1) 退火温度不合适。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。
(2) DNA模板量太少。增加DNA模板量。
(3) PCR循环数不足。增加反应循环数。
(4) 引物量不足。增加体系中引物含量。
(5) 延伸时间太短。以1kb/分钟的原则设置延伸时间。
(6) 变性时间过长。变性时间过长会导致DNA聚合酶失活。
(7) DNA模板中存在抑制剂。确保DNA模板干净
(1)酶量过高。减少酶量;酶的质量差,调换另一来源的酶。
(2)dNTP浓度过高。减少dNTP的浓度。
(3)MgCl2浓度过高。可适当降低其用量。
(4)模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng,而基因组DNA则应<200ng。
(5)引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复PCR反应。
(6)循环次数过多;增加模板量减少循环次数至30,缩短退火时间及延伸时间,或改用二种温度的PCR循环。
(7)退火温度过低。
(8)电泳体系有问题:
①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大;
②凝胶没有凝固好;
③琼脂糖质量差。
(9)若为PCR试剂盒则可能:
①由于运输储存不当引起试剂盒失效;
②试剂盒本身质量有问题,如引物选择、循环参数等选择不当。
(10)降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。
(1)引物用量偏大,引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。
(2)循环的次数过多。适当增加模板的量,减少循环次数。
(3)酶的用量偏高或酶的质量不好,应降低酶量或调换另一来源的酶。
(4)退火温度偏低,退火及延伸时间偏长。应提高退火温度,减少变性与延伸时间,也可采用二种温度的PCR扩增。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。
(5)样品处理不当。
(6)Mg2+浓度偏高,因适当调整Mg2+使用浓度。
(7)若为PCR试剂盒,也可能时试剂盒本身质量有问题。
(8)复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。
(9)反应缓冲液未完全融化或未充分混匀。确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀。
(10)引物特异性差。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
(11)引物量过多。减少反应体系中引物的用量。
(12)模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng,而基因组DNA则应<200ng。
(13)外源DNA污染。确保操作的洁净。
试剂,枪头,工作台污染。使用全新的试剂和枪头,对工作台进行清洁。
1) 污染。使用全新的试剂和枪头,对工作台进行清洁。
2) 模板或引物使用错误。更换引物和模板。
3) 基因亚型。对研究的基因进行序列分析和BLAST研究。