实时荧光定量PCRrealtime PCR
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发布时间：2017-11-21
实验材料 细胞样品
试剂、试剂盒 RNA提取试剂盒荧光定量PCR MixTRIZOLdNTP氯仿逆转录酶MMLV异丙醇Taq酶DEPC水ddH2OTEMgCl2琼脂糖溴化乙锭MOPS甲醛乙酸钠EDTAEB溴酚兰
仪器、耗材 离心管离心机风光光度计电泳槽凝胶板Realtime PCR仪
一、 样品RNA的抽提
1. 取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
2. 两相分离 每1 ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2 ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12 000 rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
3. RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12 000 rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
4. RNA清洗 移去上清液，每1 mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1 ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7 000 rpm离心5分钟。
5. RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
6. 溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
二、 RNA质量检测
1. 紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。
（1）浓度测定
A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下：
RNA溶于40 μl DEPC水中，取5 μl，1:100稀释至495 μl的TE中，测得A260 = 0.21
RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl
取5 ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为：
35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg
（2）纯度检测
RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
2. 变性琼脂糖凝胶电泳测定
（1）制胶 1 g琼脂糖溶于72 ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。
10×MOPS电泳缓冲液
浓度 成分
0.4 M MOPS，pH 7.0
0.1 M 乙酸钠
0.01 M EDTA
灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
（2）准备RNA样品 取3 μgRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10 μg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。
（3）电泳上样前凝胶须预电泳5 min，随后将样品加入上样孔。5-6 V/cm电压下2 h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3 cm。
（4）紫外透射光下观察并拍照28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。（转帖）
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