PCR扩增产物的克隆2
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发布时间：2017-11-29
实验材料 模板DNA
试剂、试剂盒 SauIKlenow片段T4连接酶
仪器、耗材 移液器移液器吸头PCR小管DNA扩增仪电泳槽电泳仪台式高速离心机
实验步骤
一、PCR反应
1. 依次混匀下列试剂
（1）H2O：35 μl
（2）10×PCR反应缓冲液：5 μl
（3）25 mmol/L MgCl2：4 μl
（4） 4种dNTP：4 μl
（5）上游引物（引物1）：0.5 μl
（6）下游引物（引物2）：0.5 μl
（7）模板DNA（约1 ng）：0.5 μl
（8）混匀后离心5秒。
2. 将混合物在94℃下加热5分钟后冰冷，迅速离心数秒， 使管壁上液滴沉至管底，加入Taq DNA聚合酶（0.5 μl约2.5 U），混匀后稍离心，加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上。
3. 用94℃变性1分钟，45℃退火1分钟， 72℃延伸2分钟， 循环35轮，进行PCR。最后一轮循环结束后， 于72℃下保温10分钟，使反应产物扩增充分。
二、电泳
取10 μl扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析，检查反应产物及长度。
三、PCR产物的纯化
扩增的PCR产物如利用T-Vector进行克隆，可直接使用，如用平未端或粘性未端连接，往往需要将产物纯化。
1. 酚/氯仿法
（1）取反应产物加100 μl TE。
（2）加等体积氯仿混匀后用微型离心机10000 rpm离心15秒，用移液器将上层水相吸至新的小管中。这样抽提一次， 可除去覆盖在表面的矿物油。
（3）再用酚:氯仿:异戊醇抽提二次，每次回收上层水相。
（4）在水相中加300 μl 95％乙醇，置-20℃下30 min沉淀。
（5）在小离心机上10000 rpm离心10 min，吸净上清液。加入1 ml 70％乙醇，稍离后，吸净上清液.重复洗涤沉淀2次。将沉淀溶于7 ml ddH2O 中，待用。
2. Wizard PCR DNA纯化系统
Wizard PCR DNA纯化系统可以快速、有效、可靠地提取PCR扩增液中的DNA，提纯后的DNA可用于测序、标记、克隆等。 该系统中含有的试剂和柱子可供50次PCR产物的纯化，试剂包括：50 ml Wizard PCR DNA纯化树 脂、5 ml 直接提取缓冲液、50支 Wizard微型柱。
（1）吸取PCR反应液水相放于1.5 ml eppendorf管中。
（2）加100 ml直接提取缓冲液，涡旋混匀。
（3）加1 ml PCR DNA纯化树脂，1分钟内涡旋混合3次。
（4）取一次性注射器， 取出注塞，并使注射筒与Wizard微型柱连接，用移液枪将上述混合液加入注射筒中，并用注塞轻推，使混合物进入微型柱。
（5）将注射器与微型柱分开，取出注塞， 再将注射筒与微型柱相连，加入2 ml 80%异丙醇，对微型柱进行清洗。
（6）取出微型柱置于eppendorf管中，12 000 g离心20秒，以除去微型柱中的洗液。
（7）将微型柱放在一个新eppendorf管中，加50 μl TE或水，静止1分钟后，12 000 g离心20秒。
（8）丢弃微型柱，eppendorf管中的溶液即为纯化DNA，存放于4℃或-20℃。
四、载体加dT尾
1. 将1 μg pUC19用SmaⅠ全酶切。
2. 在小管中按上述PCR反应，加入各种混合物，除将4 μl 4种dNTP改为4 μl 25 mM dTTP。
3. 加入1 μl(5U)的Taq DNA聚合酶在72℃下加热2 h。
4. 按前面三中所述，用酚:氯仿:异戊醇抽提二次。
5. 加入2倍体积 95％乙醇，在-20℃下沉淀1 h。
6、离心，用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于10ml ddH2O中。
五、PCR产物与载体粘末端连接
1. 在7 ml PCR产物中加1 ml带dT尾的pUC质粒。
2. 加1 ml T4DNA连接酶，1 ml 10×连接缓中液，混匀，16℃连接过夜。
3. 取5 ml连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。
六、PCR产物3'突出端切平及平末端连接
1. 在50 ml的PCR产物中，直接加0.5 ml T4 DNA聚合酶混匀。
2. 37℃反应10分钟后，70℃灭活10分钟。
3. 用酚:氯仿抽提2次。
4. 乙醇沉淀。沉淀用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于7 ml ddH2O中。
5. 质粒用Smal 切开后，70℃ 15分钟灭活酶，取1 ml （约0.1 mg）加入上述PCR产物中。加T4 DNA连接酶1 ml ，连接缓冲液1 ml 。
6. 取5 ml 连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。
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