DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。

一、实验材料及试剂

培养板、酒精灯、移液枪、CO2培养箱、流式细胞仪、荧光显微镜等；DCFH-DA、PBS、HREC、20,70-二氯二荧光素二乙酸盐（H2DCFDA; Molecular Probes）、MFL等。

二、实验内容

细胞内ROS检测：按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/升。去除四组细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。加入的体积以能充分覆盖住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的DCFH-DA不少于1ml，37℃细胞培养箱内孵育20min，用无血清的培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞的，使用激发488nm波长，525nm发射波长，用荧光显微镜和流式细胞仪检测。

细胞线粒体内检测：去除细胞培养液，培养的细胞通过20,70-二氯二荧光素二乙酸盐（H2DCFDA; Molecular Probes）检测ROS产生和线粒体特异性染料（MitoFLuor Red589; MFL;分子探针）对线粒体染色。 MFL在线粒体中累积而不管线粒体膜电位的变化，MFL发射波长是622nm，发射波长为525nm，在不同时间用PBS冲洗HREC。 将H2DCFDA和MFL分别加入以终浓度为2mM和500nM加入到不含酚红的培养基中后，将细胞在37℃下孵育45分钟，然后用新鲜的预热培养基洗涤两次，并在激光扫描共焦显微镜（LSM 510; Zeiss，Oberkochen，德国）下观察。 H2DCFDA的绿色荧光在488nm激发，MFL的红色荧光在588nm激发。 使用Zeiss软件计算每平方毫米细胞面积的平均荧光强度。

三、注意事项

1、探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。

2、探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的装载情况是否良好。

3、尽量缩短探针装载后到测定所用的时间（刺激时间除外），以减少各种可能的误差。

4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

5、对不同的细胞和组织，应选择合适的孵育时间和浓度，以观察ROS的变化。