一、原理

 

      1、E .coli 表达系统 

      E .coli 是重要的原核表达体系。在重组基因转化入E .coli 菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-PAGE 以检测表达蛋白质。

      2、外源基因的诱导表达 

      提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。常用的有温度诱导和药物诱导。本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因表达。

      不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。 

二、材料 

      1、诱导表达材料 

      (1 )LB （Luria—Bertani）)培养基 

      酵母膏 (Yeast extract)5g 蛋白胨 (Peptone)10g 

      NaCl10g 琼脂 (Agar)1-2% 

      蒸馏水 (Distilled water)1000ml pH 7.0 

      适用范围：大肠杆菌 

      (2 )IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 ml 蒸馏水中，0 .22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 ml /份，－20 ℃ 保存。 

      (3 )l× 凝胶电泳加样缓冲液： 

      50 mmol / L Tris -CI (pH 6 .8 ) 

      50 mmol / L DTT 

      2 % SDS （电泳级） 

      0.1 % 溴酚蓝 

      10 % 甘油 

      2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料 

      酶溶法 

    （1）裂解缓冲液：

 
      50 mmol / L Tris-CI (pH 8 .0 ) 

      1 mmol / L EDTA 

      100 mmol / LNaCI 

    （2）50 mmol / L

 

    （3）10 mg / ml 溶菌酶。 

    （4）脱氧胆酸。 

    （5）1 mg / ml DNase I。 

 
      超声破碎法 

 
      (1 )TE 缓冲液。

 
      (2 )2×SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液：

 
      100 mmol / L Tris-HCI (pH 8 .0 ) 

      100 mmol / L DTT 

      4 %SDS 

      0.2 % 溴酚蓝 

      20 % 甘油 

三、实验方案

      1、外源基因的诱导表达

      (1 ）用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA 和目的基因。

      (2 ）按连接步骤连接目的基因和载体，并转化到相应的宿主菌。

      (3 ）筛选出含重组子的转化菌落，提取质粒DNA 作限制性内切核酸酶图谱，DNA 序列测定，确定无误后进行下一步。

      (4 ）如果表达载体的原核启动子为PL 启动子，则在30 -32 ℃ 培养数小时，使培养液的OD600达0.4-0.6 ，迅速使温度升至42 ℃ 继续培养3 -5h ；如果表达载体的原核启动子为tac 等，则37 ℃培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG 至终浓度为1 mmol / L。继续培养3 -5h 。

      (5 ）取上述培养液1 ml ,1000g 离心，1 min ，沉淀，加100 μL 聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液后，作SDS -PAGE 检测。

      2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化

      细菌的裂解

      常用方法有：① 高温珠磨法；② 高压匀浆；③ 超声破碎法；④ 酶溶法；⑤ 化学渗透等。前三种方法属机械破碎法，并且方法① 、② 已在工业生产中得到应用，后三种方法在实验室研究中应用较为广泛。下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤。

     （1）酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶；β-1,3 -葡聚糖酶；β-1,6 -葡聚糖酶；蛋白酶；壳多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用，而其他几种酶对酵母作用显著。主要步骤为：

      ① 4 ℃ ，5000rpm 离心，15 min ，收集诱导表达的细菌培养液（100 ml ）。弃上清，约每克湿菌加3 ml 裂解缓冲液，悬浮沉淀。

      ② 每克菌加8μL PMSF 及80μL 溶菌酶，搅拌20 min ；边搅拌边每克菌加4 mg 脱氧胆酸（在冷室中进行）。

      超声破碎法。声频为15-20 kHz 的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎，在处理少量样品时操作简便，液体量损失较少，同时还可对染色体DNA 进行剪切，大大降低液体的粘稠度。

      ① 收集1 L 诱导表达的工程菌，40 ℃ ，5000r pm 离心，15 min ；弃上清，约每克湿菌加3 mlTE 缓冲液。

      ② 按超声处理仪厂家提供的功能参数进行破菌；10 000g 离心，15min ，分别收集上清液和沉淀。

      ③ 分别取少量上清和沉淀，加入等体积的2× 凝胶电泳加样缓冲液，进行SDS -PAGE 。

      注意事项：超声破碎与声频、声能、处理时间、细胞浓度、菌种类型等因素有关，应根据具体情况掌握；超声波破菌前，标本经3 -4 次冻溶后更容易破碎。
    

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