原代培养从人肾皮质外层切除的组织块为分离表达许多近段小管功能特征的细胞提 供了方法。经逐级消化分离和粗略过滤获得单个细胞和较小的细胞团，以高密度接种这些细胞时得到不均一的上皮细胞。能够获得大量细胞，有利于用多个器皿进行原代培养或扩增细胞和冻存细胞。使用这种方法的经验表明，原代细胞和传代细胞的功能特征可反映不同供体肾的功能。

实验方法原理

     将自皮质切除的组织快切成碎块，冲洗后放入胶原蛋白酶和胰蛋白酶混合液，摇晃消化。定时用吸管研磨组织块，然后手机分离的细胞。用一定孔径大小的滤网过滤细胞悬液，除去未消化的组织块。然后，洗细胞，清除消化酶。用添加血清的培养液混悬细胞，将细胞接种于塑料培养器皿。
 
试剂、试剂盒

     DMEM   FBS   胶原蛋白酶   胰蛋白酶

仪器、耗材

     手术刀   组织镊
 

实验步骤

一、材料

 无菌

      1. 基础培养液：DMEM 和 F12 混合液 50：50
 
      2. FBS（Sterile Systems, Hyclone)
 
      3. 完全培养液：DMEM 和 F12 混合液，添加 10%FBS
 
      4. BSS
 
      5. 0.1% 胶原蛋白酶（IV 型，Worthington）和 0.1% 胰蛋白酶（1：250，Sigma）混合液，用 0.15mol/L NaCl 配制
 
      6. 0.5 mg/ml DNase，用生理盐水配制
 
      7. 胰蛋白酶和 EDTA 混合液：用 0.1% 胰蛋白酶（1：250）和 1 mm/L EDTA(培养基，Sigma）配制
 
      8. 手术刀和组织镊
 
      9. 孔径为 160um 的 Nitex 滤网（Tetko）
 
      10. 培养皿和培养瓶
 
      11. 50 ml 试管

 非灭菌

       1. 有轨振荡器（Bellco）

 二、操作步骤

 消化组织

       1. 按冠状面将肾切成 5~10 mm 厚的组织片。用冰冷的基础培养液洗组织片。

       2. 从皮质的外层切下组织，然后用十字刀片切成 1~2 mm 小块。

       3. 将约 5 ml 组织块放入盛有预热的 20 ml 胶原蛋白酶和胰蛋白酶混合液的 50 ml 试管。

       4. 轻轻摇晃，孵育组织块 1 h。

       5. 吸除消化液，然后加入新鲜消化液。

       6. 每隔 20 min 收集细胞悬液，然后加入 20 ml 含有 0.5 mg/ml DNase 的培养基础液，用 10 ml 吸管轻轻研磨 10 转。

       7. 用等量的完全培养液稀释收集的细胞悬液。将稀释后的细胞悬液置于冰上。

       8. 重复收集步骤 5 次或 5 次以上，直至组织块被完全分散。

       9. 将收集的细胞悬液混合，分装如 50 ml 试管，

       10. 离心（100 g，15 min）后，用 45 ml 含 DNase 的完全培养液混悬细胞。

       11. 用孔径为 160um 的 Nitex 滤网过滤细胞悬液。

       12. 这种分离方法既分离到系抱团，又分离到单个细胞，故细胞计数不可靠。每个 75 cm2 培养瓶内放 15 ml 细胞悬液，细胞扩增后传代培养或冻存。