对于CSC的分离纯化主要有根据细胞表型特征和生物学特性而建立的两大类方法 ：

第一类：依赖于细胞表面标志的分离方法

造血系统肿瘤干细胞：正常造血干细胞的表型为CD34⁺CD38⁺Thy-1^-

实体瘤肿瘤干细胞：

A. 乳腺癌：ESA⁺CD44⁺CD24^-/LowLineage^-的细胞是乳腺癌CSC。

B. 脑肿瘤：将CD133⁺的肿瘤细胞命名为脑肿瘤干细胞(BTSC), 还表达Sox2、Musashi-1、bmi-1、磷酸丝氨酸磷酸化酶等神经干细胞和其它干细胞的基因特征

C. 结直肠癌：CD133⁺细胞是结直肠癌细胞的起始细胞。上皮细胞黏附分子、CD44、CD166可以作为鉴定结直肠癌干细胞的细胞表面标志。

以乳腺癌为例，介绍实验方法（其他肿瘤针对下面蓝色的关键词更改）：

       人乳腺肿瘤细胞分离培养：选择XXX医院肿瘤外科接受治疗的乳腺癌患者，经过患者及其家属知情同意，在手术室无菌条件下获取肿瘤组织样本约10g，置无菌组织转移液中，迅速转入无菌实验室内，PBS漂洗数遍，去除脂肪及坏死部分，将乳腺组织充分剪碎；将上述乳腺肿瘤组织移入离心管，加入8mL组织消化液（含2700U/mLⅣ型胶原酶1mL、0.02mg/mL透明质酸酶100μL、DNase50μL的DMEM培养液），轻轻混匀，37℃水浴消化1~2小时，期间每20~30min振摇离心管1次，以便充分消化；消化结束后，加入10mL PBS，摇匀后以1000r/min离心4min，弃上清，加入1mL乳腺肿瘤干细胞培养液（含10mL/L FBS，100U/mL青霉素，100mg/mL链霉素，10ng/mL bFGF，20ng/mL EGF，20ng/mL ITS的DMEM-F12培养液），混匀，1000r/min离心4min，弃上清；以1×10⁶/mL细胞密度接种于细胞培养瓶中，置入37℃、50mL/L CO₂培养箱中培养。3d后换液，约7~10d开始出现悬浮生长的细胞克隆球。

       流式细胞术检测获得乳腺肿瘤细胞：收集培养的乳腺肿瘤细胞克隆球，离心并弃去培养基；PBS漂洗1遍，Accutase消化2min后加等体积培养基终止消化；将细胞悬液移入15mL离心管1000r/min离心4min，弃上清，用PBS溶液混悬后无菌滤膜过滤，取4支试管，按如下组合顺序分别加入荧光标记抗体各10μL：IgG1-PE/IgG2-FITC，CD44-FITC/IgG1-PE，CD24-PE/IgG2-FITC，CD44-FITC/CD24-PE，再加入500μL细胞悬液入试管中，混匀，室温避光静置15min，流式细胞仪检测。

第二类 根据干细胞外排DNA结合荧光染料Hoechst33342而建立的SP细胞分离法

在Hoechst33342染色的骨髓细胞中存在着一群染色很浅的细胞群，通过紫外激发后 用双波长分别为450nm的蓝色荧光~675nm的红色荧光分析，其中有不到0.1％的细胞发 出微弱的蓝光和红光，在流式二维分析点阵图上，呈彗星状分布在造血干/祖细胞主群的一侧 ，因此被称为侧群(SP)细胞。SP细胞广泛存在于人和动物 的多种成体组织 、实体瘤及肿瘤细胞系中，并具有干细胞样特征。

实验方法：

       ① 细胞染色： 细胞消化计数，用37℃预热的DF12培养基重悬，调整到1×10⁶/mL浓度，制备成单细胞悬液；加入荧光染料Hoechst33342，使终浓度为6 μg/mL，37℃避光水浴90 min；冰上10 min终止染色，计数细胞；离心细胞后，用冰预冷DF12洗涤细胞并重悬浮，将分选组调整浓度到1×10⁷/mL以上，必要时加入1倍的DNase I；上机前再加入PI使终浓度为2 μg/mL以区分死细胞，并且400滤网过滤细胞。②  流式细胞仪检测：355 nm UV激发光源，610 nm双色短通反射滤镜，450 nm和675 nm边缘长通滤片分别检测散射光蓝光及红光部分，线性模式采集信号. 测量前向散射和侧向散射二维参数图，检测细胞均一性，以Hoechst Red为X轴，Hoechst Blue为Y轴作二维散点图，将低Hoechst Red及低Hoechst Blue且维拉帕米组缺失的区域设定为SP细胞的“门”（gate），计算百分比，分选出SP细胞及Non SP细胞。