1 AnnexinV/PI双染色法

       磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。AnnexinV是一种分子量为35~36kD的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将AnnexinV进行荧光素（FITC、PE）或Biotin标记，以标记了的AnnexinV作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶（propidineiodide，PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将AnnexinV与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

实验方法：

       XXX细胞直接收集到10mL的离心管中，每样本细胞数为（1~5）×10⁶/mL， 1000r/min离心5min，弃去培养液。用孵育缓冲液洗涤1次，1000r/min离心5min。用100μL的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10~15min。1000r/min离心5min沉淀细胞孵育缓冲液洗1次。加入荧光（SA-FLOUS）溶液4℃下孵育20min，避光并不时振动。流式细胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560nm的滤器检测PI。

       结果判断：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）。

2 TUNEL法

       TUNEL法也称DNA断裂的原位末端标记法，这一方法能对DNA分子断裂缺口中的3’-OH进行原位标记，借助一种可观测的标记物，如荧光素，能对凋亡细胞的核DNA中产生的3’-OH末端进行原位标记，用荧光显微镜即可进行观察。

实验方法：

       固定 → 透膜 → 加TUNEL反应混合物 → 加转化剂－POD → 加底物溶液 → 观察结果

       经过实验处理的细胞爬片或者细胞涂片，自然晾干，室温固定15-30 min，PBS洗涤3次，每次5 min，加封闭液，室温孵育10 min。PBS漂洗后加透膜液，室温孵育30min。制备TUNEL反应混合液，处理组用50 μL TdT＋450μL荧光素标记的dUTP液混匀；而阴性对照组仅加50μL荧光素标记的dUTP液，阳性对照组先加入100μL DNase1，反应在室温～37℃×10～30min，后面步骤同处理组。玻片干后，加50μL TUNEL反应混合液（阴性对照组仅加50μL荧光素标记的dUTP液）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×60min。PBS漂洗3次。可以加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞（激发光波长为450～500nm，检测波长为515～565nm）。玻片干后加50μl converter-POD于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×30min。PBS漂洗3次。在组织处加50～100μL DAB底物，反应15～25℃×10min。PBS漂洗3次。拍照后再用苏木素或甲基绿复染，几秒后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。加一滴PBS或甘油在视野下，用光学显微镜进行计数（200～500个细胞）并拍照。

3 线粒体膜电位(MMP)检测

       JC-1是一种碳氰化合物类阳离子荧光染料，可作为检测线粒体跨膜电位指示剂。JC-1在细胞内以聚合体和单体两种不同的物理形式存在，分别处于不同的荧光发射峰。当JC-1浓度低或膜电位水平低时，主要以单体形式存在，激发波长为527nm，呈绿色荧光；当JC-1浓度升高或线粒体膜电位水平较高时，形成聚合物，发出红色的荧光，激发波长为590nm。当细胞发生凋亡时，线粒体跨膜电位被去极化，JC-1从线粒体内释放，红光强度减弱，以单体的形式存在于胞质内发绿色荧光，根椐这一特征就可以检测线粒体膜电位的变化。

实验方法：

       用适当的方法诱导XXX细胞凋亡，收集细胞。用PBS洗涤细胞三次，收集不多于1×10⁶的细胞。取100μL 10×IncubationBuffer加900μL灭菌去离子水稀释成1×IncubationBuffer，混匀并预热至37℃。吸取500μL1×IncubationBuffer，加入1μLJC-1，涡旋混匀配成JC-1工作液。取500μLJC-1工作液将细胞均匀悬浮，37℃，5%CO₂的培养箱中孵育15~20min。室温离心（2000rpm，5min）收集细胞，用1×IncubationBuffer洗两次。吸取500μL10×IncubationBuffer重新悬浮细胞。流式细胞仪检测，分析。