为避免污染造成的损失，最小化连续细胞系的遗传改变和避免有限细胞系的老化和转化，需要冻存哺乳细胞。冻存细胞前，细胞应该特性化并检查是否污染。

     有几种普通培养基用来冻存细胞。对于包含有血清的培养基，成分可能如下：

◆包含10%甘油的完全培养基，

◆包含10%二甲基亚砜（DMSO）的完全培养基，

◆50%细胞条件培养基和50%含有10%甘油的新鲜培养基，

◆50%细胞条件培养基和50%含有10%二甲基亚砜的新鲜培养基。

        对于无血清培养基，一些普通的培养基成分可能是：

◆50%细胞条件无血清培养基和50%包含有7.5%二甲基亚砜的新鲜的无血清培养基，或

◆包含有7.5%二甲基亚砜和10%细胞培养级BSA的新鲜无血清培养基。

●计数将要冻存的活细胞。细胞应该处于对数生长期。以大约200～400 g离心5分钟沉淀细胞，使用移液管移去上清到最小体积，不要搅乱细胞。

●以1×107到5×107细胞/ml密度，在包含有血清的冷冻培养基中再次悬浮细胞，或者以0.5×107到1×107在无血清培养基中，再次悬浮细胞。

●分装进冻存管，将冻存管置于湿冰上或放入4℃冰箱中，5分钟内开始冷冻步骤。

●细胞以1℃/分钟进行冷冻，可以通过可编程序的冷冻器进行或者把隔离盒中的冻存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后转移到液氮中贮存。

●使用分离试剂从基层分离细胞，分离时尽可能温和，使对细胞的损伤减少到最小。

●在完全生长培养基中，再次悬浮分离细胞，确定有活力细胞数。

●以大约200 g离心5分钟沉淀细胞。使用移液管移去上清到最小体积，不要搅乱细胞。

●以5×106到1×106细胞/ml密度，在冻存液中悬浮细胞。

●分装进冻存管，将冻存管置于湿的冰上或放入4℃冰箱中，5分钟内开始冷冻步骤。

●细胞以1℃/分钟进行冷冻，可以通过可编程序的冷冻器进行或者把隔离盒中的冻存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后转移到液氮中贮存。

     冻存细胞较脆弱，要轻柔操作。冻存细胞要快速融化，并直接加入完全生长培养基中。若细胞对冻存剂（DMSO或甘油）敏感，离心去除冻存培养基，然后加入完全生长培养基中。

         ●取出贮存细胞，37℃水浴中快速融化。

         ●直接用完全生长培养基铺板细胞。1 ml冻存细胞使用10~20 ml完全生长培养基。进行活细胞计数，细胞接种应该至少在3×105活细胞/ml。

         ●培养细胞12到24小时，更换新鲜的完全生长培养基，去除冻存剂。

（2）离心方法

         ●取出贮存细胞，37℃水浴中快速融化。

        ●把1到2 ml冻存细胞加入到大约25 ml完全生长培养基，轻轻混匀。

        ●以大约80x g离心2到3分钟。

         ●弃去上清。

         ●在完全生长培养基轻轻再次悬浮细胞，并且进行活细胞计数。

         ●细胞铺板，细胞接种应该至少为3×105活细胞/ml。