蛋白印迹（Western blot, WB）是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种试验方法，是将蛋白质通过SDS-PAGE电泳后，再转移到杂交膜上，然后通过抗原抗体复合物对特定蛋白质进行特异性检测的方法。

一、检测原理
    

    待测蛋白根据其性质（分子量、分子大小、电荷以及其等电点）采用电泳方法进行分离，通过电流将凝胶中的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，利用一抗与抗原特异性结合的原理，以抗体作为探针钓取目的蛋白。

二、 样品处理及上样

1、取15-20ug蛋白，加2倍SDS上样缓冲液7ul，DDW定容至总体积14ul。

* 上样总体积一般少于15ul，加样孔的最大限度可加20ul样品。

2、95℃孵育5min，使蛋白变性。

3、电泳槽内加入足够的电泳液。

4、上样，分子Marker也要一起上样，用微量进样器贴壁吸取样品，加样器枪头插到加样孔中缓慢加入样品。

*样品吸出时不要吸进气泡。加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出，加下一个样品时，进样器枪头需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，一面交叉污染，有条件最好加样时一个样品换一个枪头。

三、 电泳

电泳条件：电压200V，电流8mA，染料进入分离胶时电流增加到16mA，时间一般2-3小时。

*溴酚蓝刚跑出胶即可终止电泳进行转膜，也可以根据时间经验停止电泳。

*电泳后检测蛋白是否迁移正确与平均，可采用铜染色或考马斯亮蓝染色检测，如凝胶中的蛋白需要进行转膜则需要可逆的铜染法，否则采用不可逆考马斯亮蓝法。

*铜染色法：

    电泳胶用蒸馏水洗数秒钟    加入0.3mol/LCuCl2染色5-10min    去离子水洗一次     暗室观察蓝色背景下出现的蛋白透明条带    胶置于0.1-0.25mol/L Tris/0.25mol/L EDTA(PH 8.0)缓冲液中漂洗脱色两次    电转缓冲液中转膜。

*考马斯亮蓝法：用40%双蒸水/10%醋酸/50%甲醇的溶液固定胶中蛋白    考马斯亮蓝R-250染色室温染色4h过夜，保持摇匀     转入67.5%双蒸水/7.5%醋酸/25%甲醇摇匀脱色   蛋白被染成深蓝色。

四、 转膜

    转膜方式有半干式和湿转两种。半干式转膜速度快，但高分子量蛋白转膜效果较差。高分子量蛋白质与胶相互作用较强，从胶中移出较难。因此，一般大于120-150kDa的蛋白用半干式转膜时，可选用碱性电转缓冲液，也可在电转缓冲液中加SDS。但SDS妨碍蛋白与膜的结合，尤其对小分子蛋白。湿转成功率高，特别适用于大分子量（大于100kDa）的蛋白。

操作步骤：

1、 准备：切好的PVDF膜和滤纸置于甲醇5min，PVDF膜置于电转缓冲液浸泡10min以上。

*转一张膜需6张6cm×9cm滤纸和1张6cm×9cmPVDF膜，滤纸和膜的尺寸不能小余胶的尺寸，否则导致电流不能通过膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因手上的蛋白会污染膜。

2、 加有转膜液搪瓷盘中放入转膜用的已浸过的PVDF膜和滤纸。

3、 电泳结束后撬掉玻璃板取胶，除去小玻璃板，轻轻刮去浓缩胶。

4 、小心剥下分离胶盖于已泡好的滤纸上。

5 、200V电压，160mA稳流电，转膜1h。

6 、转完后将膜和滤纸扔掉，PVDF膜右上角用剪子切断一小部分进行标记，Marker用红蓝铅笔进行标记。

7、 PVDF膜放入PBS-T溶液，振荡5min×3次。

五、 抗原-抗体反应

1 、仪器和设备

塑料盒、振荡器。

2、 封闭

一般采用5%脱脂奶粉进行封闭，室温，30-60min。

*封闭液的浓度可以是（1%-5%），根据自己的条件摸索浓度就可以。

封闭液的配置除了PBS-T液之外也可以使用TBS-T液或10mmol/L Tris-HCL(PH 7.4)溶液。

3 、一抗的处理

（1）一抗稀释倍数：根据样本和抗体的种类不同，预实验寻找选择最适稀释倍数。

（2）一抗孵育时间：一抗的孵育时间是从几个小时到过夜不等，建议使用较高较高的稀释倍数和较长的孵育时间来保证特异性结合。一抗过高会产生非特异性条带。

（3）一抗孵育时间：尽可能低温孵育，特别是磷酸化一抗过夜时应在4℃进行，否则会产生污染而破坏磷酸化蛋白。

*孵育一抗最好在摇床上进行，防止结合不均匀。

4 、二抗的处理

（1）常用二抗：HRP偶联二抗。也可用碱性磷酸酶标记二抗，但不够灵敏。

（2）二抗稀释液：PBS/PBS-T液、TBS/TBS-T液、一般的封闭液等。

（3）二抗稀释倍数：根据二抗说明书推荐倍数稀释二抗。也可按1：100-1：20000常规稀释倍数进行预实验选择最适稀释倍数。如二抗的浓度过高可导致非特异性条带。

二抗孵育时间：一般室温孵育1h。

5 、实验步骤

（1）封闭结束后，用PBS-T液轻轻清洗膜，去除封闭液。

（2）用一抗室温孵育1h或4℃过夜。

（3）PBS-T液清洗，10min×3次。

（4）二抗孵育，室温，1h。

（5）PBS-T液清洗，10min×3次。

（6）用显色液显色。

六 、显色

酶和底物反应显色是蛋白印迹法的最后一步，一般常用酶有HRP和AP，根据成像底物可分为显色底物和发光底物。发光底物可选用HRP标记二抗，显色底物可选用HRP标记二抗或AP标记二抗。显色分为酶促底物发光和化学发光或荧光法。

1、HRP标记二抗

（1）酶促底物发光法

DAB显色液配制：50ml

配方如下：

DAB
1mol/L Tri-HCL(pH 7.4)

DDW

*现配现用，避光保存。

*显色前每50ml加入30%过氧化氢7.5ul。

*敏感性较ECL差。DAB是致癌物质，配制时应戴手套。显色后膜可用DDW清洗，风干保存。

2、AP标记二抗

显色液配置

（1）100×氯化硝基四氮唑蓝（NBT）：

10ml配方如下：

NBT                   0.33g

70%二甲基甲酰胺       10ml

*1.5ml离心管分装后冷冻保存，可保存数月。

（2）100×溴氯吲哚基磷酸盐(BCIP)：

10ml配方如下:

BCIP                  0.165g

100%二甲基甲酰胺      10ml

*难溶时用10ml蒸馏水，配成50×溶液。分装冷冻保存，可保存数月。

3.碱性磷酸酶缓冲液：100ml配方如下。

1mol/L Tris-HCL(pH 9.5)                 10ml

5mol/L NaCl                           2ml

1mol/L MgCl2                         0.5ml

DDW                                87.5ml

*冷藏保存，可保存数月。

4、显色液

100BCIP                              0.1ml

100×NBT                             0.1ml

*显色后用DDW清洗，风干保存。

七、蛋白印迹实验常见问题及原因分析

1. 没有带？

原因：样品中抗原含量不足（抗原表达量过低；蛋白降解；上样量不足；样品制备错误）；制胶浓度比例不合适；转膜不完全；一抗稀释浓度过大；一抗与二抗不匹配；显色系统灵敏度不足。

2.非特异性杂带

原因：封闭或清洗不彻底；一抗浓度过高；蛋白降解；抗体的特异性差；蛋白形成二聚体；