编者的话：对一些刚入门的科研小白们来说，免疫组化步骤较为繁琐，一步错，则步步错。也有很多实验伙伴向中洪君吐槽，明明觉得都按照老师们提供的条件做，可惜就是没有得到预期结果。今天中洪老司机就教大家这样做！

1、石蜡切片和冰冻切片的选择比较

2、一抗的选点和技巧

（1）单克隆和多克隆抗体的选择。单克隆和多克隆抗体的内在特征决定了它们用于IHC/ICC时的优势和限制。单克隆抗体由单个B细胞克隆产生，代表了同质群体，能够高亲和力高特异性地与单个表位结合。这在检测蛋白家族的某个成员时特别有用，因为蛋白家族有着高比例的氨基酸同源性。

抗体结合往往依赖于目标蛋白维持其天然的构想状态。与其他蛋白的相互作用、翻译后修饰、温度、pH、固定和盐浓度都会影响抗体接近目的表位。多克隆抗体是异质的，可识别多个表位，因此它们较少受到蛋白构象变化的影响。

一般而言，多克隆抗体在一定pH和盐浓度范围内也比单克隆抗体更为稳定。基于这些原因，多克隆抗体更常用于IHC/ICC实验。

（2）应用范围的选择。有的一抗只能用于Western Blotting,或免疫组化、免疫荧光、免疫沉淀等;甚至表明石蜡切片或冰冻切片。

（3）种属反应性的选择。这一点很重要，表明这种抗体可能存在种属差异，且这种抗体适合检测哪种种属动物体内的抗原。

（4）种属来源，一般兔来源的多是多克隆;而小鼠来源的多是单克隆，但也有另外。根据此来源来选择相应的二抗。

（5）生产厂家的选择。

3、封闭血清的选择原则

（1）膜上或切片上有剩余的位点可以非特异性吸附抗体，造成后续结果的假阳性。

（2）封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合，否则在后面的步骤中如果和二抗发生结合，会造成背景。

（3）也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。

4、PBS 的清洗方式选择、次数和时间的选择

（1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。　

临床上每天检测的病例很多，所用的抗体种类及项目也多，如果在加入一抗孵育完后，将它们在一个缸内洗，这样就会造成交叉污染，影响最后的结果。正确的做法是单独地进行冲洗，冲洗的 PBS 为一次性，保证切片没有相互交叉污染的机会。

（2）温柔冲洗，防止切片的脱落。

冲洗切片，取出切片，将 PBS 从上轻轻地冲洗，让 PBS 自上而下流下来，不要拿起切片将 PBS 对准切片冲洗，这样由于冲出的 PBS 有一定的冲击力，很容易使切片周边引起松动，导致切片的脱落。

（3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。

冲洗切片有人提出用微振荡器振染，振下未结合的各种物，使之不产生背景，此种做法一是浪费时间，二是很容易导致切片的脱落。切片的冲洗据实践认为，用一小烧杯柔和地于切片上冲洗，就能彻底冲洗去未结合的物质，无需附加其它条件，冲洗好于切片上再注入 PBS，持续 2 min 左右就完全足够了。

5、一抗 4℃ 孵育后为什么要进行 37℃复温？

（1）一方面，防止切片从 4ºC 直接放入 PBS 易脱片。

（2）另一方面，使抗原抗体结合更稳定。一般不需要，但对表达较弱的抗原可能有用，4ºC 和 37ºC 时分子运动方式不同，前者分子碰撞机率和运动速度小于后者,后者结合更快，但敏感性也提高了并易造成非特异染色。

6、免疫组化结果如何分析

（1）阳性着色细胞计数法。在 40 * 光镜下，随机选择不重叠的 10 个视野，人工或机器计数阳性着色细胞，每组 3-6 张不同动物组织切片，然后进行组间比较即可。

（2）灰密度分析法。通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用 image j 进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。

（3）评分法。通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度（0-3 分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色）、阳性范围进行评分（1-4 分为 0-25%、26-50%、51-75%、76-100%），最终可以分数相加，再进行比较。

对于以上这几种方法，各有利弊，请细心选择。要想得到正确结果的前提是你要做出着色均匀、背景很浅的高质量切片。