中洪实拍孵育抗体图

抗体孵育流程

1、把封闭好的膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，加入一抗溶液孵育。摇床上缓慢摇动，4℃过夜。

2、用洗膜缓冲液漂洗PVDF膜2次，每次7min。把膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，加入二抗溶液孵育。摇床上缓慢摇动，室温1h。

3、用洗膜缓冲液漂洗PVDF膜3次，每次7min。

抗体哪家强？

WB实验里面最为昂贵的产品可能就是抗体了，知名的抗体品牌很多，Abcam，CST，Millipore，BD，Santa，R&D等都是实验中常用的国外品牌，国内品牌Boster还可以，但是在WB领域建议首选CST，因为CST性价比相对较高，且使用浓度一般按推荐的就可以了，抗体效价高。

当然由于CST抗体产品种类远远不能满足每一位研究者的需要，那么就需要大家在其他如Abcam、Millipore等品牌中选择需要的抗体，这里建议大家的是选择抗体的时候，最好看看说明书里面是否有可供参考的验证图片或者有文献使用了该抗体发表的图片，因为图片可以在很大程度上看出抗体的特异性如何。

内参抗体的选择

内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。详细可参考下放内参选择表：

抗体“疑难杂症”

1. 一抗，二抗的比例是否重要？

解答：比较重要，调整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特异的本底。

2. 做细胞信号传导，要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求？

解答：对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用HRP标记的二抗。

3. 同一公司的另外抗体用这个稀释度做出来效果很好，所以没做预试，怕费时间，用什么样的稀释度比较好呢？我用的ECL+plus试剂盒显色。转膜过夜，一抗孵育也是过夜的，若封闭也过夜的话就要四天才看的到结果了。

解答：不同抗体，即使是同一公司的抗体，其最佳的抗体稀释度也是不一样的，需要你实验摸索。我觉得转膜过夜好像没有必要吧，转膜的目的也就是将蛋白转到膜上就行啦，何必浪费时间呢。至于具体的转膜时间，还要看你的目的蛋白分子量的大小；转膜的设备，是半干式，还是湿式。一抗当然可以过夜，如果你想所短Western Blot时间的话，可以增高一抗的孵育温度，我们实验室一般37度，两小时就足够了；你可以参照抗体说明书。至于一抗和二抗得稀释度，你可以一抗1：1500；二抗1：20000试试。另外建议你洗膜时，多洗几次，最好是在封闭；一抗和二抗后至少是5x5min，跑一张好膜不容易，多尽点心吧，这样不会浪费你的时间，只会节省你的时间！

4. 免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗？

解答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。（限于单抗）

5. Western Blot 中抗体的重复应用问题。

解答：抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2－3次。稀释后应在2－3天内使用，4度保存，避免反复冻融。