EMSA主要基于蛋白-探针复合物在在凝胶电泳过程中迁移较慢的原理。根据实验设计特异性和非特异性探针，当核酸探针与样本蛋白混合孵育时，样本中可以与核酸探针结合的蛋白质与探针形成蛋白-探针复合物；这种复合物由于分子量大，在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移较慢，而没有结合蛋白的探针则较快；孵育的样本在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜后，蛋白-探针复合物会在膜靠前的位置形成一条带，说明有蛋白与目标探针发送互作。

      1、实验前准备

      （2）样本制备

      （3）探针制备

      （1）在0.5ml离心管中按顺序将下列组份混匀：

      （3）PCR仪中室温（20-23℃）温育30min。

      （1）制备6.5%非变性聚丙烯酰胺凝胶：（注意根据试剂情况按比例调整总体积）

      5XTBE                                  1ml

      （2）按标准步骤制备凝胶。

      （3）加样前先在预冷的0.5X TBE buffer中120V预电泳10min，与电泳完毕后冲洗加样孔。

      （4）混合样本及电泳缓冲液，点样电泳。

     （5）将电泳槽置于冰上或者4℃环境中，恒压100V进行电泳，直至缓冲液指示带距离凝胶底部2~3cm为止。（大约50-60min，根据实际情况调整电泳时间及电压；电泳时间不宜过长）

     （1）在预冷的0.5XTBE中浸泡凝胶，膜，滤纸和纤维垫。

      （2）按如下顺序组装“三明治”：纤维垫，滤纸，凝胶，膜，滤纸，纤维垫。注意电极，确保凝胶位于阴极、膜位于阳极。

      （3）在预冷的0.5XTBE中进行转膜。转膜装置应置于冰上或者低温室中，恒压60V转膜1h。（注意根据实际情况调整电压及时间）。

      （1）去除转好的膜，放入合适的盛有缓冲液的容器中，冲洗。（注意整个检测过程避免膜干燥）

      （2）去掉冲洗缓冲液，加入封闭液后轻微震荡，室温封闭20min。

      （3）加入适量的HRP酶标记的链霉亲和素（Streptavidin-HRP conjugate），室温震荡孵育45min。（勿将酶标记物直接加到膜上）

      （4）去掉酶联物稀释液，用洗涤缓冲液洗膜三次，每次室温轻微震荡1 0min。

      （5）配置反应底物，均匀加至膜上，室温孵育5min。（可以在加完底物后，用薄膜轻轻覆盖在膜上，是底物均匀覆盖，注意不要产生气泡）

      （6）化学发光成像系统曝光成像（曝光时间的长短可以根据检测方法不同而进行相应调整）。

      （本文转载丁香通）