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凝胶迁移实验(EMSA)实验方法(二)

      三、实验结果展示(美国Signosis EMSA实验结果)





      四、Super-Shift EMSA


      非纯化的蛋白样本和一个特定的探针可形成一个或几个特异的蛋白复合物。确定复合物中蛋白的特征可能会困难,可以加入目的蛋白的抗体,进行超迁移实验,即Super-Shift EMSA。抗体和蛋白/探针复合物中的蛋白结合,使复合物的迁移延迟,形成超迁移。

Super-Shift EMSA工作原理;在反应体系中,抗体与DNA/蛋白复合物中的蛋白产生反应形成复合物会引起复合物的体积变大,在非变性凝胶中的移动变慢而与DNA/蛋白复合物区别开。


      进行Super-Shift EMSA需要考虑以下因素:


      1)一般先做一般的EMSA测定,成功后才考虑做Super-Shift EMSA实验。


      2)不是所有的抗体都可以用于Super-Shift EMSA,只有对非变性蛋白的表面抗原决定簇起反应的抗体才能够用于Super-Shift EMSA。


      3)抗体的浓度要高。一般10-20ul的反应液需要使用0.5-1ul原倍的抗体。


      4)为减少非特异性反应,尽量使用纯化的抗体。


      5)单抗与多抗都可用于Super-Shift EMSA,但多抗可能与DNA/蛋白复合物形成大的聚集物而不进胶。在这种情况下,虽然看不到Super-Shift的带,但应当可以看到DAN/蛋白复合物的电泳带明显减少。


      (本文转载丁香通)

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