FISH（荧光原位杂交）技术我们常应用于 mRNA、miRNA 及 lncRNA 等表达及定位分析，步骤不算复杂，但想做出一张漂亮的片子也不是很容易，那么在FISH实验中都有哪些套路？现在中洪君就和大家分享一下，希望给你带来一些帮助！

（请耐心花2分钟阅读完本文，建议推荐给小伙伴一起学）

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FISH实验原理

荧光原位杂交(Fluorescence In Situ Hybridization，FISH)是20世纪80年代初在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。其基本原理是以荧光素标记的单链核酸为探针，根据碱基互补配对原则,经过共变性—退火—复性的过程使探针与样本DNA的互补区域杂交，与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和实现多重染色等特点。

（荧光实拍图，请勿盗用）

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实验流程

FISH样本的制备→探针的制备→探针标记→杂交→染色体显带→荧光显微镜检测→结果分析。 

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实验步骤（甲酰胺法）

▲  玻片准备： 

将已收获的标本滴在玻片上，在显微 镜下观察滴片质量并标记杂交区域。

理想的标本 质量为：细胞分布均匀不重叠，密度适中，胞浆 含量少。将玻片放入已37℃水浴预温的 2×SSC 溶液中，老化30 min。70％ 、85％ 、100％ 的乙 醇中室温下梯度脱水各2到3分钟，室温下晾干。

玻片DNA变性：

将玻片放入已在73±1℃  水浴中预热的70%甲酰胺/2×SSC混合液  中，每缸≤4张玻片变性3～5min，取出分别在70%、80%、100%冰乙醇缸中脱水各2分钟而使变性终止。玻片室温下晾干。   

▲ 探针变性： 

①探针准备（按产品说明书配制不同探针） 

例：LSI BCR/ABL双标双融合易位探针准备如下：

a. 杂交液（buffer）   7μl 

b. H2O                      2μl 

c. 探针                       1μl 

d. 加入到0.5ml离心管中混匀，离心1～3秒。 

②将装有探针的离心管放入73±1℃水浴箱中，变 性处理5分钟，移至37℃水浴箱中预杂交5min。 

▲ 杂交：将10μl探针加在玻片上已划定的杂  交区域内，用22×22mm盖玻片盖好，注意  避免气泡的出现，再用封片胶封好四周，略干后放入保湿盒内，在37℃恒温箱中杂  交16～18h。   

▲洗涤：

①将3缸50%甲酰胺/2×SSC溶液中，2缸 2×SSC置46±1℃水浴箱中预温30 min。

②将杂交后的玻片去除盖玻片依次放入已 46±1℃预温的1、2、3号50%甲酰胺/2×SSC 溶液缸中，每缸≤4张玻片，洗涤各10 min。

③将玻片转至已46±1℃预温的2×SSC溶液 中，洗涤各5 min。 

▲ 复染：每个杂交区域加DAPIⅡ10μl，盖玻 片封片，室温中复染15分钟。  

▲ 镜检：每张片随机分析计数200～1000个间 期核，并记录杂交信号。

▲杂交仪法

玻片准备：同甲酰胺程序的玻片处理

探针准备：同甲酰胺程序

杂交：    

①将10μl探针混合液加在玻片上划定的杂交区域 内，用22×22mm盖玻片盖好，封片胶封片，将 玻片放入杂交仪或恒温热平台上。  

②杂交仪设置：变性温度72-75℃，时间2～5min， 杂交温度37℃，时间16～18h 

洗涤：同甲酰胺程序

复染：同甲酰胺程序

镜检：同甲酰胺程序

▲快速BM涂片 

1）标本处理：骨髓涂片放入3:1 甲醇冰醋酸固定液中5-10 分钟；2×SSC溶液两缸各浸泡5分钟  • 70％ 、85％ 、100％ 的乙醇中室温下梯度 脱水各2到3分钟，室温下晾干 暗视野下选取杂交区域，其余步骤同杂交仪法。

（石蜡切片实拍图）

2）石蜡切片FISH 

组织切片的制备、脱蜡和水化 

①制备 切片机切下厚度为4-5um组织，37℃水浴展 片，贴于玻片上，晾干，56 ℃烤过夜。 

②脱蜡 用钻石笔标出杂交区域，将切片浸入二甲 苯中,10分钟×2次，室温用100％的无水乙醇脱水， 5分钟×2次 

③水化 将玻片依次浸入室温100%、85%、70% 乙醇各2分钟水化。

3）增强组织通透性处理

①将蒸馏水和2ml EDTA加入压力锅烧沸

②将玻片置入沸水中，加热至喷汽

③转入蒸馏水中2分钟  

4）蛋白酶处理 

①将蛋白酶预温至37 ℃，切片浸入20分钟

②转入蒸馏水中1分钟，再依次脱水

③室温风干  

5）FISH杂交、洗涤、观察同“杂交仪法”  

膀胱癌脱落细胞FISH

收集晨尿，离心，收集细胞沉淀。

低渗、预固定和固定同“染色体制备”。

FISH操作步骤同“杂交仪法”。

镜检注意：选择DAPI下染色不均一、核大、椭 圆的脱落细胞观察，排除炎症细胞。

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注意事项

FISH对检测的条件要求很高。检测过程中的温度、试剂的酸碱度，反应的时间都会对结果产生影响。因此在操作中应注意：

1）杂交前样本的老化相当重要，尤其是胃蛋白酶的浓度、消化的时间掌握不好，直接影响杂交的效果。若消化过度，细胞出现“鬼影”或整个组织消失成为废片；若消化不足，则显示持续的自发荧光或者差的DAPI染色；

2）操作过程中的温度控制应严格按照产品说明书，而且在反应前把液体预温到所要求的温度，检测中所使用的设备例如盖玻片、载玻片都应注意预热；

3）各步骤时间应准确，每次操作都要迅速；

4）为防止淬灭，杂交后的洗脱和晾干要注意避光。可以加入抗淬灭剂；

5） 此种片在-20℃避光保存1周。若要长期保存，应加入抗淬灭剂。