一. 实验原理及背景

原位杂交可分为菌落原位杂交和组织原位杂交。

菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂解以释放DNA。将DNA烘干固定于膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释放出DNA。将DNA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。

组织原位杂交简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落的原位杂交不同。菌落原位杂交需要裂解细菌释放DNA，然后进行杂交。而原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。

二. 具体步骤

1、将加入探针的杂交液先于50℃预热，均匀涂于切片表面，加上硅化盖玻片，放于湿盒中，50℃孵育12-16h。

2、1×SSC（含50%甲酰胺），50℃洗涤2次，每次10min。

3、2×SSC（含50%甲酰胺），37℃洗涤10min。

4、2×SSC（0.5ug/ml RNaseA），37℃洗涤30min。

5、1×SSC，50℃洗涤10min。

6、1×PBS（含0.1%Tween20），50℃洗涤2次，每次10min。

7、PBT室温洗涤10min。

8、封闭液处理1-1.5h。

9、加抗体（用封闭剂按1:500比例稀释），均匀地涂于切片表面，放于湿盒中，室温1-2h后4℃过夜（抗体1:500稀释于1×封闭液）。

10、PBT洗涤3次，每次15min。

11、显色缓冲液洗5min。

12、滴加显色液，黑暗中显色至适度。可在显微镜下多次观察。

13、显色终止液洗10min，双蒸水洗5次。

14、甲基绿（0.25%）滴加染色几秒中，双真水洗5min。

15、脱水封片。

三、注意事项

1、 原位杂交固定的目的是为了保持细胞结构，最大限度地保存细胞内DNA或RNA的水平，使探针易于进入细胞或组织。DNA较稳定，RNA易被酶解，在RNA定位上，若要使RNA的降解减少到最低限度，取材后应尽快予以冷冻或固定。

2、 玻片包括盖片和载玻片用热肥皂水刷洗，自来水清洗干净后，置于清洁液中浸泡24h，清水洗净烘干，95%乙醇中浸泡24h后蒸馏水冲洗、烘干，烘箱温度最好在150℃或以上过夜除去所有RNA酶。盖玻片在有条件时最好用硅化处理，锡箔纸包裹无尘存放。

3、 由于在手指皮肤及实验玻璃皿上均可能有RNA酶，为防止其污染影响实验结果，在整个杂交前一日置高温（240℃）烘烤以达到消除RNA酶的目的。要破坏RNA酶，其最低温度必须在150℃左右。

4、 整个实验过程中，切勿切片干燥，否则会严重影响实验结果。

四、部分试剂配置

1、 0.1mol/L三乙醇胺-0.25%乙酸酐：三乙醇胺13.2ml，氯化钠5g，浓盐酸4ml，DEPC水定容至约1000ml，临用前，一边摇动溶液一边加入乙酸酐2.5ml，充分混合。

2、 10×PBS：氯化钠 80g，Na2HPO4·12H2O2 32.3g，NaH2PO4·2H2O2 4.5g。加DEPC水900ml，用HCl/NaOH调pH至7.2，最后定容为1000ml。

3、 20×SSC（pH=7.0）：氯化钠175.3g，枸橼酸钠88.2g，DEPC水（ddH2O）定容至1L。

4、 100×Denhardts：Ficoll1g，PVP1g，BSA1g，DEPC水定容至50mL。

5、 预杂交液：2×SSC，50%甲酰胺，100ug/ml变性鱼精DNA，5×Denhardts。

6、 杂交液：2×SSC，50%甲酰胺,1×Denhardts,250μg/mL酵母tRNA或100μg/mL变性鱼精DNA,10mmol/L Tris-HC1 (pH7.5)，0.5％SDS，5％葡聚糖硫酸酯，标记探针。

7、 PBT：1×PBS，0.1％Triton×100，2mg/mL BSA使用前加入。

8、 封闭液：0.1mol/L Tris-HCI pH7.5，0.15mol/L NaCI，0.5％羊血清或2％BSA。

9、 显色缓冲液：100mmol/L Tris-HCI pH9.5，100mmol/L NaCI，50mmol/L MgCl2。

10、 显色液：4.5μL/mL NBT，3.5μL/mL BCIP，用显色缓冲液配制。

11、 显色终止液：0.1mol/L Tris-HCl pH8.0，10mmol/L EDTA。