血清中 miRNA 抽提和实验设计经验谈
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发布时间：2017-11-15
血液中 miRNA 的组成
血液中的 miRNA 到底是从何而来? 要往哪里 去? 这些 miRNA 的生理功能是什么? 以上这三个问题是很多研究人员关心的问题，事实上这些问 题目前并没有很明确的答案，我们知道 miRNA 是 内生性的短片段 RNA，长度约 17 到 23 核苷酸， miRNA 可以藉由和信息 RNA（mRNA）结合诱导 信息 RNA 的降解，进而调控信息 RNA 和相对蛋 白的表现。根据一些论文的揭示 1 和实验室实际的 操作经验显示，正常人的血液中 miRNA 的含量是 极微量的，但是在病人和检体制备不佳的血液样 本中却可抽取到较大量的 miRNA，根据这些观察 现象的合理臆测，病人血清中 miRNA 的来源，很 有可能是因疾病造成的组织坏死或细胞凋亡破裂 而流泄出来的胞内 miRNA，经由病人和正常人的 基因表现的芯片图谱比较，结果也倾向有或无表 现的差异，而非特定 miRNA 表现量上升；换言之，我们观察到相关的研究中，病人的 miRNA 的表 现数目增加了，而分析ㄧ些在正常人和病人中都 有表现的 miRNA，表现量的高、低反而是其次的 表征。因此数据分析的逻辑和方法也必须根据之 而调整，但这些呈现异位性表现（ectopic expression）的 miRNA 并不影响其成为诊断疾病 和预后评估的标志的可能性。已经有一些研究指 出，这些不经常表现在循环系统的 miRNA 可以成 为良好的疾病诊断标志，如 miR-141 可以作为前 列腺癌的指标，miR-499 及 miR-208 和心肌梗塞（myocardial infraction）相关，miR-122 和药物 造成的肝脏损伤有关。
血清中 miRNA 抽提的挑战
1 、检体的备制
血清（serum）好还是血浆（plasma）好?临床上会根据检验的标的来选择血液检体的保存及制备方式，血清和血浆都是来自血液检体的成分，但是根据制备的方式导致本质上含有成分 有所不同。基于制备的方法可知，血清是血液经 由凝血反应后，再经由离心沈淀所得到的上清液。而血浆则是血液在不凝血的状况下，经由离心 去除血球后的液体。然而有文献指出，针对同一 个人的血清和血浆样本抽提出来的 miRNA 的总量作比较，很明显的血清抽提的总量明显比血浆抽 提的来得高，这意谓着制备的方法也会影响 miRNA 的抽提，据推测这些 miRNA 可能是因为 凝血反应，血小板或红血球破裂后释出的物质， 其中包含 miRNA，虽然大部分的实时定量聚合链 反应（q-PCR）验证结果显示，血浆和血液的 miRNA 的表现图谱并无显著差异，然而这个已经 存在的风险，可能在研究设计也是需要被考虑， 因此就理论上来说，是以血浆的检体较适合作为 生物标记的找寻 。
2、检体的备制或保存不良是否可用?
已知血清或血浆中的 miRNA 的来源可能来自胞 内和胞外，尤其是血球（红血球或白血球等），因此 处理方式不当会造成检体的污染，改变 miRNA 的 组成和表现量，造成研究结果的偏差，尤其红血 球的溶血现象影响甚剧，不仅会造成红血球 miRNA 污染而且红血球中的大片段 mRNA 亦会 造成定量的失准和因降解而形成实验的伪阳性产生（图一）。因此备制检体时也要避免造成血球破裂 的动作，如用太细的针头抽血、或检体保存不当 造成溶血、或病人本身因疾病或治疗造成的败血 或溶血现象可能也是必须列入评估的考虑因素。 此外抗凝血剂的使用必须避免使用含有肝素 heparin 的凝血管，已知 heparin 会抑制反转录（reverse transcription）和聚合酶（polymerase）的反应，如果检体会进行 q-PCR 的验证一定要避 免。同样的血液检体也含有抑制反转录和聚合酶 的成分，如果萃取时没有移除干净则会造成后续 实验的失败产生。
图 一 .为血清抽提 miRNA 后，经由 Agilent Bioanalyzer2100 分析的 RNA 图谱，结果显示提 取成功，提出物中只有 miRNA 片段留存 。图二同图一的实验操作步骤 ，结果显示虽然提取是成功的 ， 但是提出物中出现大片断的可疑 DNA 或 RNA 片段 ， 可能原始的检体中有溶血的现象等干扰因素 。
miRNA 的定量
在抽提成功的情形下，血清和血浆中仅含有少量的 RNA，1 mL 血的抽提总量可能都在 ng 甚或 pg 等级，这样的结果意谓着，运用现行的分亮度 计来测 OD 是不可行的（以 NaroDrop 为例：待测 浓度需高达 10ng/uL 才可信），而 Agilent bioana- lyzer 2100 也仅能做到定性的检测，没法做精准的 定量。检视现行被使用的定量方法大概有：（一）在 等体积的血清或血液样本中加入外控核酸 （spike），经由抽提步骤后可经由侦测外加的 spike 来校 正抽提的总量及效率，作为校正检体因抽提效率 或误差造成的差异。然而这只适用在检体备制完 美及控制抽取技术无误，对于个体表现差异大和 检体备制质量不一的检体，并没有办法达到管控 的效用；（二）经过分亮度计测 OD 加以定量，但是 除非抽提出的量达到分亮度计的可信水平，否则 这些数值大概都是假讯号，并不足以采信；（三）使用内控基因的表现量来做为校正。但根据研究 指出其实血清或血浆中 miRNA 的表现数量是有很 大的个体差异的，以正常人当研究对象分析其表 现的 miRNA 数量，最低 123 个；最高有 296 个 ，可以有高达两倍的差距，再加上没有适合的内 控基因 （internal control gene）可以做为控制组，公认常用的内控基因 U6 或 SNORD RNAs 等，在个体间的表现也是差异很大并不适用 1,2。因此 透过 Agilent Bioanalyzer 2100 的结果进行 miRNA 相对定量；或从等体积血清抽提出 miRNA 再等比例取出进行实验，似乎是较可信的做法， 但是还是要取决于实验的设计来决定。
结语
当我们理解了实验的设计和预期可能的结果， 避开了可能的干扰因素，做完芯片实验拿到结果 后，可能要先审视一下原始数据再决定要用那种 方法来分析数据，例如；假设控制组只有表现 200 个 miRNA，但是病人组表现 400 个，那经常 被使用的芯片校正方法如：median scaling 或 75th percentile，可能就不适用
（本文转载丁香通）
